Адъюванты
25.10.2015
Как отмечалось ранее, одними из первых созданных модификаторов иммунного ответа были адъюванты. Их использование в качестве компонентов создаваемых конъюгированных и форсификационных вакцин максимализирует их эффективность, особенно в случае применения препаратов, характеризующихся недостаточно высокой или малой иммуногенностью (низкоиммуногенными являются антигены опухолей, выделенные и очищенные отдельные эпитопы бактериальных, вирусных или иных антигенов, генно-инженерные конструкции). Применение адъювантов позволяет интенсифицировать иммунный ответ, снизить дозу вводимого антигена, уменьшить кратность его введений, пролонгировать периоды .между повторными инъекциями антигена за счет усиления иммунологической памяти. Индуцированный введением адъюванта воспалительный ответ обеспечивает вовлечение в развивающийся процесс лимфоцитов, дендритных клеток и макрофагов, интенсифицируя защитные возможности организма.
Механизмы действия адъювантов характеризуются тремя основными типами. Указанные механизмы действия, отдельные из них или в комплексе, характеризуют не только ранее разработанные, но и ныне создаваемые адъювантные соединения:
- депонирующий эффект (создавая депо для антигена, адъюванты защищают его от быстрой деградации и пролонгируют иммунный ответ). К такого рода адъювантам относят соли алюминия [гидроокись алюминия — Al(OH)3, фосфат алюминия — AlPO4, алюминиевокалиевые квасцы — KAl(SO4)2], кальция [фосфорнокислый кальций — Ca(PO3)2], адъюванты типа Фрейнда — полный и неполный. В отличие от полного адъюванта Фрейнда, содержащего убитые туберкулезные микобактерии в минеральном масле, неполный адъювант Фрейнда содержит только минеральное масло в виде водно-масляной эмульсии. Минеральные сорбенты (диаметр частиц 0,1-10 мкМ) входят в состав адсорбированных анатоксинов и химических вакцин, активируют выработку антител, фактически не влияя на выраженность ГЗТ или на цитотоксическое действие Т-лимфоцитов фенотипа CD8, высоко реактогенны, в редких случаях применяются в ветеринарии. Как и неполный адъювант Фрейнда, минеральные сорбенты активируют антигенпредставляющие клетки и хелперы типа Th2. При использовании полного адъюванта Фрейнда преимущественно активируются хелперы типа Th1 (табл. 17.1). Адъюванты Фрейнда в клинической практике не применяются (индуцируют образование стерильных гранулем и абсцессов в месте инъекции), используются только лишь в экспериментальных исследованиях.
В последние годы разработан ряд водно-масляных эмульсий, включаемых в качестве адъювантов в состав вакцин, пригодных для использования не только в ветеринарии, но и в здравоохранении. Имеются в виду водно-масляные эмульсии Montanide ISA51 и Montanide ISA720, включаемые в состав вакцин против ВИЧ/СПИДа, малярии и цитомегаловирусной инфекции, и водно-масляная эмульсия MF59, используемая для усиления иммуногенности вакцины против гриппа.
Адъюванты Montanide ISA51 и Montanide ISA720 стимулируют продукцию антител и цитотоксическую активность Т-клеток, MF59 активирует Тh2-тип Т-клеток фенотипа CD4, но не цитотоксическую активность Т-лимфоцитов. Водно-масляная эмульсия AS02 активирует Т-зависимую и T-независимую продукцию антител так же, как клеточный иммунитет, опосредованный цитотоксической активностью Т-клеток фенотипа CD8. Адъювант AS02 включает 3D-MPL — нетоксичное производное липида А и QS21 — сапонин высокой очистки в качестве одной из фракций экстракта коры южно-американского дерева Quillaja saponaria. По данным P.M. Хаитова и соавт., адъювант AS02 используют в составе вакцины против ВИЧ/СПИДа. В состав адъюванта AS04 входит гидроокись алюминия и монофосфория-липид А. Такой адъювант включают в вакцину против вируса папилломы человека для профилактики рака шейки матки.
Р.И. Атауллаханов с соавт. в качестве адъюванта использовал выделенный из растений водорастворимый кислый пептидогликан с мол. массой 1200 - 40000 кД. Адъювант активирует макрофаги, моноциты, дендритные клетки, NK-лимфоциты, усиливает продукцию антител и цитокинов. Конъюгирование пептидогликана с разными антигенами (яичный альбумин; рекомбинантный полипептид, содержащий иммунодоминантные фрагменты белков ВИЧ-1 — gag р 17, р24, gp120, gp41; рекомбинантный полипептид — аминокислотные остатки 1-76 — белка оболочки коронавируса, ассоциированного с атипичной пневмонией) в 10-100 раз повышало иммуногенность белкового антигена.
Новый тип водно-масляной эмульсии SAF (Syntex adjuvant formulation) содержит в качестве иммуностимулирующего соединения треонил-мурамил дипептид и неионный блок полимерного сурфактанта poloxamer 401. В качестве метаболизируемого масла адъювант содержит сквален (С30Н50), в качестве эмульгатора — полисорбат 80. Адъювант активирует как клеточный, так и гуморальный ответ к ряду антигенов, однако в клинической практике не используется. Это связано с тем, что мурамилдипептид (N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглутамина), входящий в состав адъюванта (характеризуется минимально-структурным составом, обеспечивающим адъювантные качества препарата), обладает существенной реактогенностью.
Другой прием депонирования антигена заключается в применении биодеградируемых микрокапсул, включающих молекулы искомого антигена и состоящих, например, из полимера поли(лактид-ко-гликолида) (PLG), цианоакрилата [поли(бутил-2-цианоакрилат] или наночастиц поли (метил-метакрилата). Такие адъюванты проявляют способность активировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ.
- активация функций антигенпредставляющих клеток. Антигены, например растворимые, сорбированные на микрочастицах адъюванта, более эффективно подвергаются эндоцитозу. Иначе говоря, становится более эффективной доставка антигена антигенпредставляющим клеткам и более эффективной его деградация. Это активирует процесс представления антигена антигенпредставляющими клетками. В целях более эффективной доставки антигена его включают также в эмульсии, в иммуностимулирующие комплексы ISCOM (Immune-stimulating complexes) или в липосомы. Комплекс ISCOM (см. табл. 17.1) содержит растительный адъювант сапонин, холестерин и фосфолипиды, представляет собой сферические молекулы, в которых очищенный сапонин Quil А или QS21, соединенный с антигеном через гидрофобную связь, образует мицелии в присутствии холестерина. Сапонин в неочищенном виде высокотоксичен, при частичной очистке его токсичность снижена (Quil А), в случае высокой очистки препарат (QS21) существенно менее токсичен. Считается, что адъюванты на основе сапонина стимулируют активность клеток типа Th1. Однако ISCOM в зависимости от используемого антигена может активировать Th1 или Тh2. Несмотря на использование очищенного сапонина, адъювант ISCOM был реактогенным, по-видимому, вследствие гемолитической активности сапонина. Дальнейшая модификация адъюванта включала выделенную и хорошо охарактеризованную фракцию сапонина — ISCOPREP, липиды в форме ди-палмитоил фосфатидилхолина и холестерина и неионный детергент деканоил-М-метилглюкамид, инкубированные в буферном растворе. Адъювант не антигенен, получил название ISCOMATRIX, при использовании с антигеном индуцирует синтез антител класса IgG, активирует клетки фенотипа CD8, предполагается его использование в составе человеческих вакцин.
Помимо сапонина в ветеринарии в качестве адъювантов, стимулирующих иммунный ответ, применяют лизолецитин, глюканы, декстрансульфат, ацеманнан и др. Биодеградируемые микрочастицы, содержащие инкорпорированный антиген, обычно по размерам подобны бактериям и легко фагоцитируются. Адъюванты на основе липосом содержат холестерин, димиристоил фосфатидилхолин, монофосфорил липид А, димиристоил фосфатидил глицерин, применяемые совместно с антигенами возбудителей малярии, гепатита, холеры, с дифтерийными и столбнячными анатоксинами. Разрабатываются адъюванты с применением липосом, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах. Ряд разрабатываемых адъювантов содержит протеосомы и виросомы — мультимерные белки бактериальных мембран и агрегаты трансмембранных вирусных белков (например гемагглютинин вируса гриппа).
- селективная активация Th1 или Th2 в результате костимуляции и усиления продукции цитокинов. Обычно эффект достигается в результате взаимодействия рецепторов эффекторных клеток врожденного иммунитета (дендритные клетки, макрофаги) с бактериальными антигенами, включаемыми в состав вакцинирующих препаратов. Так, например, туберкулезные микобактерии (Mycobacterium tuberculosis), включаемые в состав полного адъюванта Фрейнда, содержат мурамилдипептид (n - ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин), способный активировать дендритные клетки и макрофаги через рецепторы NOD2 (Nucleotide-binding oligomerization domain 2). Комплексные микробные продукты, включаемые в состав адъювантов, могут активировать также антигенпредставляющие клетки через PRR-рецепторы типа TLR (Toll-like receptors). Это сопровождается продукцией ИЛ-1 и ИЛ-12 — цитокинов, усиливающих Т-клеточный ответ (Th1 или Тh2 в зависимости от используемых микробных продуктов) и фокусирующих ответ на формировании реакций адаптивного иммунитета. Обычно в качестве TLR-активирующих агентов используют липоподисахариды или их продукты. Такие препараты обладают иммуностимулирующей активностью, содействующей неспецифической резистентности к бактериальным инфекциям, активируют продукцию антител (Th2), не влияют на клеточный ответ и могут отменять толерантность. Стимулирующей активностью обладают коринебактерии (Corynebacterium parvum), которые при использовании их в качестве адъюванта усиливают антибактериальную и противоопухолевую активность животных, активируют Тh1. Убитые микробы — возбудители коклюша (Bordetella pertussis) — активируют Th2, макрофаги и селективную продукцию IgE, усиливают иммунологическую память.
Адъювантное действие микробов изучалось и на примерах вирусных антигенов. Их применение основывалось на способности связываться с многими Тоll-подобными рецепторами (TLR). Показано, например, что вакцина, представленная аттенуированным вирусом желтой лихорадки активирует многие формы иммунокомпетентных клеток человека и дендритные клетки мышей in vitro, взаимодействуя с TLR2, 7, 8 и 9. Это сопровождается активацией Th1 и Th2, а также индукцией антиген-специфических ЦТЛ фенотипа CD8. Сходные свойства проявляют вирусы коксаки В, кори, ньюкаслской болезни, активирующие клетки иммунной системы (ДК) через взаимодействие с TLR8, TLR2 и TLR7 соответственно. Вирусная активация клеток системы иммунитета может осуществляться и через другие PRR-рецепторы клеток, например через маннозные рецепторы или через рецепторы для лектинов типа С.
Специального внимания заслуживают разработки мукозальных адъювантов с использованием бактериальных энтеротоксинов, в частности, холерного (CT) и термолабильного токсинов (LT), выделенных из Escherichia coli. Их совместное введение с белковыми антигенами индуцирует развитие как мукозального, так и системного иммунного ответа. Как известно, холерный токсин состоит из двух структурно и функционально различных субъединиц — А и В. Субъединица В токсина (CT-B) является пентамером, связывается с ганглиозидами GM1 эпителия, давая возможность субъединице A (CT-A) проникать в цитозоль клетки-мишени и повышать активность цАМФ. LT также связывается с GM1, но, кроме того, с ганглиозидами GM2 и асиало-GM1. Поскольку как CT, так и LT обладают помимо адъювантных токсическими свойствами, они были подвергнуты сайт-направленному мутагенезу с заменой отдельных аминокислот в активной части субъединицы А. Полученные мутантные молекулы (CT S63K и LT S63К) характеризовались такой же способностью индуцировать формирование секреторного IgA и сывороточного IgG, как и нативные формы токсина, однако их токсичность была существенно снижена. Анализ адъювантного действия синтетических производных CT и LT детально проанализирован Р.В. Петровым и P.M. Хаитовым в известной монографии «Искусственные антигены и вакцины».
Поскольку большинство природных адъювантов обладает выраженным побочным действием, существенно значимой является разработка синтетических полимерных соединений, лишенных побочных эффектов, обладающих иммуностимулирующей активностью, растворимых в воде, пригодных для использования в качестве носителей для различных высокоочищенных белковых и гаптенных молекул, используемых в конструируемых вакцинирующих препаратах. Анализируя возможность использования синтетических препаратов в качестве адъювантов для искусственных вакцин, RB. Петров и PM. Хаитов подразделяют новые природные и искусственные синтетические соединения на три основные группы:
• природные высокополимерные соединения (полисахариды бактериального и растительного происхождения, бактериальные гликопептиды, нуклеиновые кислоты;
• искусственно синтезированные аналоги природных полимерных соединений (синтетические полинуклеотиды, полипептиды, гликопептиды);
• искусственно синтезированные полимерные соединения, не имеющие природных аналогов (синтетические карбоцепные и гетероцепные полианионы и поликатионы).
Направленный синтез таких соединений позволяет создавать препараты, лишенные нежелательных побочных реакций, таких как образование гранулем в месте введения адъювантов, полиартритов, сенсибилизации к микобактериям, входящим в состав адъювантов, индукции аллергий, возможного опухолевого роста, аутоиммунных осложнений, гипертрофии лимфоидной ткани и др. Наглядным примером может служить полмоксидоний — сополимер N-окси 1,4-этиленпиперазина и (М-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида. Синтезированное А.В. Некрасовым соединение является биодеградируемым высокомолекулярным (мол. массой около 100 кД) препаратом, разрешенным к клиническому применению как в качестве адъюванта в составе разрабатываемых вакцин, так и в качестве самостоятельного лечебного препарата с иммуностимулирующими свойствами. Важными свойствами химически чистого N-оксидированного производного полиэтиленпиперазина являются его иммуномодулирующие, детоксицирующие, антиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства. Уникальные свойства полиоксидония позволили использовать его в качестве адъюванта в составе конструируемых вакцин, в частности, в составе конъюгированной полимер-субъединичной вакцины «Гриппол», широко используемой для вакцинации населения против гриппа, в составе вакцины «ВИЧРЕПОЛ» против ВИЧ/СПИДа, успешно проходящей клинические испытания или в составе разрабатываемых аллерговакцин (аллерготропины). Другой синтетический адъювант, включающий комплекс полиадениловой и полиуридиловой кислот (polyA:U), применяется как иммуностимулирующий препарат под названием «Полудан».
Разработка адъюванта на основе иммуностимулирующих комплексов по-лиинозиновой и полицитидиловой (polyI:C) и полиадениловой и полиуридиловой кислот (po!yA:U) привела к созданию препарата CpG ODN (Oligodeoxy-ribonncleotides containing CpG motifs) — олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие динуклеотид CG с неметилированным нуклеотидом С (CpG). Показано, что адъювант CpG ODN способствует представлению антигена и продукции цитокинов клетками типа Th1, характеризуется наличием трех классов — А, В и С. Класс А активирует NK- и ДК-, но слабо стимулирует В-клетки. Класс В адъюванта, наоборот, обладает выраженным активирующим действием на ДК- и В-клетки, но слабо активирует NK-клетки и продукцию ИНФγ. Класс С адъюванта обладает качествами адъювантов А и В, оказывает выраженное стимулирующее действие на формирование ЦТЛ фенотипа CD8.
Важно отметить, что такие синтетические адъюванты, как соединение 1018, состоящее из ряда нуклеотидов, конъюгированные с аллергенами, например из пыльцы амброзии, индуцировали у мышей сильный ответ типа Thl по сравнению с Th2-ответом, индуцированным при применении свободного аллергена без адъюванта. Проведенный PB. Петровым и PM. Хаитовым анализ показал, что синтетические полиэлектролиты не проявляют антигенных или аллергенных свойств. Более того, было установлено, что иммуностимулирующее действие полиэлектролита, обеспечивающее продукцию антител класса IgG, не распространяется на продукцию аллергических IgE-антител. Включение белка с выраженными аллергенными свойствами в состав искусственного комплекса не только не усиливало его аллергенную активность, но приводило к выработке блокирующих IgG-антител. Вскрытые факты используются для создания высокобезопасных вакцин нового поколения с повышенной иммунизирующей активностью как против непобежденных инфекций, так и против аллергий.
Оценка выраженности иммунного ответа животных к разным антигенам, проведенная рядом авторов, продемонстрировала высокую адъювантную активность ряда синтетических неприродных полиэлектролитов: полианионов — полиакриловой кислоты, декстран-сульфата или поликатионов — поли-4-винилпиридина, поли-2-метил-5-винилпиридина и др. Высокую адъювантную активность проявили четвертичные соли поликонидина.
Накапливается опыт применения цитокинов (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-12, ИНФγ, ФНОα, ГМ-КСФ и др.) в качестве адъювантов для активации функций АПК, T- и В-лимфоцитов. В отличие от адъювантов, обеспечивающих депонирование антигена (фосфат или гидроокись алюминия или адъюванты, построенные по типу «масло в воде»), адъюванты микробного происхождения или цитокины обеспечивают направленную доставку антигена непосредственно к клеткам и иммунной системы без образования тяжелого очага воспаления.
