Новости
28.03.2024
28.03.2024
27.03.2024
|
Определение активности комплемента в сыворотке крови калориметрическим методом по Густову15.11.2014
Приборы: ФЭК, термостат, центрифуга, пробирки центрифужные, пипетки на 0,1; 1; 2; 5; 10 мл, колбы конические, стаканы химические, колбы мерные на 250, 500, 1000 мл. 5. Гемолитическая сыворотка: для анализа используют гемолитическую сыворотку с титром не ниже 1 : 1200, которую разводят в четыре раза. Например: титр гемолиза 1 : 1200, расчет делают путем деления 1200 : 4 = 300. Потом рассчитывают количество гемолитической сыворотки по числу исследуемых проб. Если готовят систему на 60 мл, то рассчитывают по формуле: X = 60 : 300 = 0,2 60,0 - 0,2 = 59,8. Берут 0,2 мл гемолитической сыворотки, прибавляют 59,8 мл буфера, получают 60. Ход определения. В центрифужные пробирки наливают по 3 мл рабочего буфера и вносят по 0,2-0,4 мл (дозу определяют возрастом птицы) сыворотки. Опыт сопровождается постановкой двух контролей: К1 - (контроль гемолитической системы) - в пробирку вносят 3 мл рабочего раствора буфера. К2 - (контроль стопроцентного гемолиза) - в пробирку наливают 3 мл бидистиллированной воды. Равные объемы 2,5%-ной по осадку взвеси эритроцитов и разведенной по тройному титру гемолитической сыворотки смешивают, вливая разведенную сыворотку во взвесь эритроцитов («белое» в «красное»), получают гемолитическую систему. Опытные пробирки, пробирки К1 и К2, гемолитическую систему ставят в термостат на 30 мин. при температуре +39°С. Затем гемолитическую систему перемешивают и по 2 мл вливают во все пробирки (опытные и контрольные). Содержимое пробирок осторожно встряхивают и выдерживают в термостате в течение 45 мин. при температуре +39°С. Во время термостатирования через 15 мин. пробы перемешивают, затем пробирки охлаждают 10 мин. в холодильнике и центрифугируют при 3000 об/мин. 10 мин. Надосадочную жидкость калориметрируют на ФЭКе при условиях, аналогичных стандартизации взвеси эритроцитов. Процент гемолиза вычисляют по формуле: Х = ОПо / ОПк х 100%, где: X - процент гемолиза; ОПо - оптическая плотность опытных проб; ОПк - оптическая плотность контроля.
|