Определение литической активности β-лизинов в сыворотки крови ускоренным методом
15.11.2014
Приборы: фотоэлектрокалориметр ФЭК (любой марки), термостат, водяная баня, химические пробирки, пипетки на 1,5 и 10 мл, стерильная марля.
Реактивы: Бидистиллированная вода, культура Bacillus subtilis, 0,75 М раствор сахарозы с pH = 6,2.
Готовят буфер: 25,67 г сахарозы растворяют в 100 мл бидистиллированной воды, постепенно кипятят 10-15 мин., а затем стерильно закрывают. Раствор сахарозы готовят перед употреблением.
Ход определения.
Испытуемую сыворотку разливают по 0,2 мл в три пробирки с обозначением: первая пробирка-контроль К; вторая - Д1 - показатель оптической плотности до термостатирования; третья - Д2 -показатель оптической плотности после термостатирования.
Пробирки ставят в водяную баню при температуре +56° С (для разрушения термолабильных начал). В это время готовят стандартную культуру: смывают 3-4 пробирки посевов суточной культуры 0,75 М раствором сахарозы и фильтруют его через 2 слоя стерильной марли. Взвесь стандартизируют на ФЭКе против 3 мм. Стандартная взвесь должна соответствовать 0,500 ед. показания правого барабана по красной шкале. После выдерживания в бане пробам дают остыть до комнатной температуры. В пробирки Д1 и Д2 наливают по 0,4 мл стандартной культуры и встряхивают. Пробирки Д2 ставят в термостат при температуре +39°С на 2 часа. Контрольные пробирки и пробирки Д1 ставят на 2 часа в холодильник при температуре +4°С. По истечении времени термостатирования в опытные пробирки Д1 и Д2 добавляют по 0,6 мл раствора сахарозы, а в контрольные пробирки - по 1 мл. После этого пробирки встряхивают и фотометрируют на ФЭКе, при тех же условиях, которые соблюдались при стандартизации исходной культуры, только фотометрируют против каждого своего контроля пробирки с обозначением К.
Процент лизиса вычисляют по формуле:
Х = Д1 - Д2 / Д1 х 100%,
где: Х - литическая активность Р-лизинов, %;
Д1 - показатель оптической плотности до термостатирования;
Д2 - показатель оптической плотности после термостатирования.
