Определение фосфора липоидов
15.11.2014
Реактивы: этиловый спирт, серный эфир, серная кислота (хч), концентрированная, перикись водорода, 30%-ный раствор, молибденовокислый аммоний, 8 н. серная кислота, однозамещеный фосфорнокислый калий, бидистилированная вода, хлороформ.
Приборы: спектрофотометр или ФЭК-56, пробирки с притертой пробкой, пробирки химические, воронки размером 35 мм, фильтры бумажные, обезжиренные и обеззоленные, пипетки мерные на 0,1; 0,2; 1; 2; 5 и 10 мл.
Приготовление реактивов:
1. Смесь Блюра (3 части перегнанного этилового спирта и 1 часть серного эфира).
2. 10%-ный раствор молибденовокислого аммония на 8-нормальной серной кислоте. Реактив не стоек, его надо хранить в темной склянке.
3. Стандартный раствор фосфора (основной). 2,197 г химически чистого однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РO4), предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. Затем добавляют 2,5 мл хлороформа. В 1 мл основного раствора содержится 1 мг фосфора.
4. Рабочие стандартные растворы фосфора:
1-й раствор - 10 мл основного стандартного раствора разводят водой до 100 мл. Затем добавляют 0,5 хлороформа. В 1 мл раствора содержится 0,1 мг фосфора.
2-й раствор - 20 мл основного стандартного раствора разводят водой до 100 мл. Затем добавляют 0,5 хлороформа. В 1 мл приготовленного раствора содержится 0,2 мг фосфора.
3-й раствор - 30 мл основного стандартного раствора разводят водой до 100 мл. Добавляют 0,5 мл хлороформа. В 1 мл раствора содержится 0,3 мг фосфора.
4-й раствор - 40 мл основного стандартного раствора разводят водой до 100 мл. К нему добавляют 0,5 мл хлороформа. В 1 мл содержится 0,4 мг фосфора.
Все водные растворы готовят на бидистиллированной воде.
Ход определения.
В пробирку с притертой пробкой помешают 4 мл смеси Блюра и вливают по каплям 0,2 мл сыворотки крови и тщательно перемешивают. Закрывают притертой пробкой и ставят в кипящую водяную баню на 30 секунд. Охлаждают и фильтруют через обезжиренный фильтр в химическую пробирку. Первую пробирку споласкивают 3 раза (по 1-1,5 мл) смесью Блюра и фильтруют через тот же фильтр. В химическую пробирку с фильтратом добавляют 0,1 мл концентрированной серной кислоты и на песочной бане осторожно начинают сжигать. Когда большая часть фильтрата испарится, а остальной побуреет, к нему после охлаждения добавляют 0,1 мл пергидроля и продолжают сжигание до тех пор, пока раствор сделается бесцветным. При необходимости можно повторно добавить 0,1 мл перекиси водорода. После добавления пергидроля и обесцвечивания раствора сжигание необходимо продолжать еще в течение 1-1,5 часов. После сжигания пробирку охлаждают. В нее добавляют 0,1 мл бидистиллированной воды и 3 мл спирта, орошая стенки. Непосредственно перед фотокалориметрированием в пробирку вливают 0,4 мл раствора молибденовокислого аммония. При добавлении этого реактива необходимо избегать действия яркого солнечного цвета. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. На приборе ФЭК-56 работают с синим светофильтром (№ 3).
Определение фосфора производят в ультрафиолете при 390 ммк, используют кюветы с рабочей длиной 5 мм. В параллельные кюветы наливают дистиллированную воду.
Для каждой серии анализов строят калибровочную кривую по следующей схеме (табл. 7).
Построение одновременно с опытными пробами калибровочной кривой дает уверенность в полученных результатах, так как работа проводится в одинаковых условиях с одними и теми же реактивами. Количество фосфолипидов в крови вычисляют путем умножения полученного числа на коэффициент 23,5.
