Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител методами иммунобиотехнологии

25.10.2015

Современная методология получения моноклональных антител (мкАТ) базируется на использовании методов иммунобиотехнологии, в частности, на методах получения гибридных клеток, характеризующихся слиянием цитоплазмы, ядер и объединением их хромосомных наборов. Партнерами для гибридизации служат:
• опухолевые клетки (способны к неограниченному размножению in vitro, но не способны к продукции специфических антител); для гибридизации обычно используют мутантные миеломные клетки, лишенные гипоксантингуанинфосфо-рибозилтрансферазы (ГГФРТ) или тимидин-киназы;
• В-лимфоциты (способны вырабатывать антитела, но не способны к длительному размножению in vitro). Для гибридизации обычно используют спленоциты или лимфоциты периферической крови мышей, иммунизированных искомым антигеном.
Получение межвидовых гибридов (например человек-мышь) по сравнению с получением внутривидовых гибридов (например мышь-мышь) представляет собой существенно более сложную процедуру, нередко сопровождающуюся утратой хромосом одного из гибридных партнеров (обычно человека). Эффективность слияния клеток и их функциональная активность также выше в препаратах внутривидовых гибридом.
За выбором партнеров гибридизации следует этап слияния опухолевых клеток и лимфоцитов (этап получения гибридных клеток) в присутствии полиэтиленгликоля или других агентов, способствующих слиянию клеток (лизолецитин, вирус Сендай, сильное электрическое ноле).
После слияния клетки помещают в селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин, тимидин (ГАТ). Б такой среде опухолевые клетки, лишенные одного из указанных ферментов, погибают. Погибают также лимфоциты, имеющие эти ферменты, но не способные к длительному культивированию in vitro без добавления факторов роста. Выживают лишь гибридные клетки, имеющие необходимые ферменты и унаследовавшие от лимфоцитов способность вырабатывать антитела, а от опухолевых клеток — способность к длительному культивированию in vitro. В качестве селективной используют также среду, содержащую азасерин-гипоксантин (Аза-Г) для получения гибридом с использованием Т-клеточных линий, например человека, лишенных ГГФРТ.
Следующий этап — тестирование растущих популяций гибридных клеток на выработку специфических антител, отбор соответствующих моноклонов методом лимитирующих разведений и их выращивание. Обычно в культуре содержится 50-80% антитело синтезирующих гибридных клеток, тогда как среди ядросодержащих клеток селезенки гипериммунизированных животных количество продуцентов антител составляет 0,5-1,0%.
Отобранные моноклоны затем тиражируют в массовой культуре или гибридомы переводят в брюшную полость сингенного реципиента с целью накопления асцита как источника антител. Обычно культуральная жидкость содержит 10-20 мкг/мл-1 антител, асцитная жидкость — 10 мг/мл Для усиления образования асцита мышей-реципиентов облучают в дозе 3-3,5 Гp или вводят им пристан.
На всех этапах выращивания моноклонов, начиная с первичных этапов получения гибридных клеток, часть культур замораживают, сохраняя клетки от возможных потерь вследствие возможного случайного нарушения технологического режима, сопровождающегося гибелью клеток.
Принципиальная схема получения моноклональных антител показана на рис. 19.1.

Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител  методами иммунобиотехнологии

Получаемые этой методологией моноклональные антитела характеризуются моноспецифичностью. Они используются для определения различных специфичностей при характеристике антигенов, анализе тонких механизмов функционирования различных звеньев и этапов системы иммунитета, при оценке иммунного статуса особи с помощью маркирования отдельных клеточных субпопуляций и др. Моноклональные антитела применяются не только в качестве различного рода диагностических средств. Они находят применение и в качестве терапевтических препаратов. Примером могут служить исследования RL. Sadowski и соавт. по оральному применению моноклональных антител, специфических к энтеротоксигенному штамму E.coli типа К99 (76-95% изолятов) у новорожденных телят и свиней. Введение моноклональных антител животным в пределах 4-12 час. после рождения, а затем их заражение живой культурой бактерий сопровождалось выживанием 79% поросят и 86% телят (табл. 19.1).
Совершенствование гибридомной техники и достигнутые успехи в получении продуктов моноклонов привели к созданию нового вида гибридом, названных гибридными гибридомами или квадромами. Разработаны также различные методы получения химерных антител, проявляющих, как и квадромы, биспецифическую активность.
Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител  методами иммунобиотехнологии

Квадромы получают путем гибридизации двух гибридом, каждая из которых продуцирует моноклональные антитела к различным антигенам. Получаемые антитела являются биспецифическими, имеющими активные центры не одной, как в обычных гибридомах, а двух разных специфичностей. Методология получения квадром принципиально не отличается от таковой, используемой для образования моногибридом.
В качестве примера может быть приведена методология получения гибридной гибридомы, вырабатывающей специфические антитела как к столбнячному анатоксину, так и к поверхностному антигену вируса гепатита В (антиген HBs), т.е. антитела, обладающие биспецифической активностью. Для получения таких антител гибридизовали трансформированную вирусом Эпштейна-Варр линию В-лимфоцитов человека, продуцирующую моноклональные антитела (IgGlx) к столбнячному анатоксину и чувствительную к строфантину, но резистентную к азасерину-гипоксантину, с гибридной линией (человек-мышь) клеток, вырабатывающей моноклональные антитела (IgGlA.) к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBs) и резистентную к строфантину, но чувствительную к азасерину-гипоксантину. Селекцию клеток квадромы проводили в селективной культуральной среде, содержащей азасерин-гипоксантин и строфантин. Показано, что получаемые биспецифические антитела в 25-3000 раз более эффективны в комплементзависимом лизисе клеток-мишеней, несущих два различных поверхностных антигена, по сравнению с родительскими моноклональными антителами.
Один из принципов создания химерных антител продемонстрирован G.T. Stevenson и соавт. Моноклональные антитела, специфические к двум разным антигенам, а также нормальные иммуноглобулины с помощью ферментов (папаин, пепсин) разрезали на Fab- и Fc-фрагменты. Затем Fc-фрагменты нормальных иммуноглобулинов с помощью бисмалеимида связывали с Fab-фрагментами антител разной специфичности (рис. 19.2). Получаемые химерные биспецифические антитела проявляли существенно большую активность по сравнению с родительскими антителами.
Последовательные этапы работы:
* разрезание молекул IgG на Fab- и Fc-фрагменты папаином и пепсином;
* выделение Fab- и Fc-фрагментов;
* связывание бисмалеимидом Fс- и Fab-фрагментов в химерную молекулу с биспецифической активностью: bisFabFc.
Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител  методами иммунобиотехнологии

Другой способ получения химерных антител базируется на генетической основе, осуществляется в результате генетической трансфекции, путем соединения генов вариабельных областей иммуноглобулинов мыши с константными областями иммуноглобулинов человека. Разработанная методология дает возможность получения иммуноглобулинов двух типов — химерных антител, 65-90% которых представлены иммуноглобулинами человека, и гуманизированных антител, на 95% состоящих из человеческих антител. В химерных антителах константные регионы — человеческие, вариабельные — мышиные. В гуманизированных антителах даже вариабельный регион характеризуется человеческим происхождением, однако он содержит мышиную последовательность аминокислот (рис. 19.3).
Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител  методами иммунобиотехнологии

Вне зависимости от способа получения важной особенностью химерных антител мышь-человек является в случае клинического применения их меньшая иммуногенность для человека (принципиально для любого вида животных, получающих химерные антитела с их видовой основой в виде Fc-фрагмента) по сравнению с только мышиными моноклональными антителами. Тем не менее иммуногенность таких химерных антител для человека остается достаточно высокой. Для ее снижения антитела «гуманизируют», т.е. делают их еще менее иммуногенными для человека. С этой целью генные сегменты, кодирующие все шесть гипервариабельных участков Fab-фрагментов (по три сегмента в легкой и тяжелой цепях иммуноглобулинов), определяющих комплементарность (CDR) молекулы мышиного антитела, соединяют с генами иммуноглобулинов человека. Получаемые при этом моноклональные антитела являются полностью человеческими, за исключением их гипервариабельных областей. Совершенно очевидно, что указанные принципы получения антител распространяются на различные виды животных.
Дальнейшая разработка проблемы использования специфических моноклональных антител для диагностических и терапевтических целей нашла отражение в создании методологии получения мини-антител, т.е. минимальных по размерам антител, представленных вариабельными доменами тяжелых (Vн) и легких (V1) цепей с антигенраспознающей способностью, связанных друг с другом гибким пептидным линкером типа (Gly4Ser)3, устойчивым к действию протеаз (рис. 19.4). Связывание пептидной связью двух мини-антител одинаковой специфичности позволяет получить диантитело, биспецифических мини-антител — биспецифическое антитело и т.д. Мини-антитела могут нарабатываться в значительных количествах в клетках прокариотов (например в Escherichia coli) под контролем соответствующего промотора. Их использование перспективно для адресной доставки к клеткам-мишеням необходимых продуктов — лекарственных препаратов и противоопухолевых средств, токсинов, ферментов, радиоактивных изотопов и др.
Получение моноклональных, биспецифических и химерных антител  методами иммунобиотехнологии

Повышенной стабильностью, устойчивостью к протеолизу, растворимостью и авидностью обладают комплексы, конструируемые на основе миниантител, соединенных с модулем барназа-барстар. Барназа — это рибонуклеаза с мол. массой 12 кД, состоящая из 110 аминокислотных остатков, вырабатывается микробами Bacillus amyloliquefaciens. Барстар — цитоплазматический ингибитор барназы, состоит из 89 аминокислотных остатков, его мол. масса составляет 10 кД. Модуль барназа-барстар является очень прочным и стабильным соединением молекулярных структур, N- и С-концы модуля находятся вне зоны связывания двух белков, поэтому свободны для связывания, например с мини-антителами (рис. 19.4). Связывание модуля барназа-барстар с миниантителами приводит к образованию устойчивых комплексов — димерных, гримерных. В таких комплексах антитела, подобно естественным антителам, сохраняют способность к сгибанию и ротационному движению. Комплекс мини-антител с барназой-барстаром был успешно использован для определения локализации опухолевого роста.
Рекомбинантные молекулы, преимущественно направленные против различных внутриклеточных макромолекулярных структур, в т.ч. органелл, называют интрателами. Эти молекулы характеризуются как моноцепьевые структуры, сформированные антигенсвязывающими участками (доменами) Н- и L-цепей иммуноглобулина и связанные межцепьевым (линкерным/якорным) пептидом.
Совершенно очевидно, что конструирование молекулярных структур типа комплексов сформированных мини-антител или комплексов миниантитело-барназа-барстар, предназначенных для адресной доставки биологически активных соединений к клеткам-мишеням с целью определения их локализации или воздействия на их функции, представляет собой элемент новой быстроразвивающейся и высокоперспективной дисциплины — нанобиотехнологии.
Другими примерами успешного применения нанобиотехнологических приемов в медицине могут служить достижения в области конструирования вакцин нового поколения против инфекций (ДНК-вакцины на основе конструирования вирусного генома, конъюгированные полимер-субъединичные вакцины и др.) или аллергий (аллерговакцины или аллерготропины типа Берпол, Тимпол, Полпол). При конструировании ДПК-вакцин на основе ви русного генома используется «вирусная платформа», представляющая собой вирус с «вырезанной» частью генома, взамен которой встраивается участок генома другого вируса, против которого создается иммунитет. Для создания конъюгированных полимер-субъединичных вакцин применяют выделенные и очищенные протективные субъединицы антигенных структур поверхности микроба, соединенные с иммуностимулирующим полимером, в частности полиоксидонием (типа вакцины «Гриппол»). Такие вакцины обеспечивают высокий иммунный ответ вне зависимости от наличия генов высокого или низкого иммунного ответа, т.е. индуцируют проявление фенотипической коррекции генного контроля иммунитета. Аллерготропины (аллерговакцины) разрабатываются по этому же принципу. Они состоят из очищенного аллергоида (аллерген, обработанный формальдегидом), соединенного с иммуностимулирующим полимером — полиоксидонием. Применение таких вакцин обеспечивает индукцию Т-хелперов первого типа (Th1) вместо Th2 и индукцию протективных антител изотипа IgG вместо аллергических антител изотипа IgE. Аллерготропины на основе аллергоидов из пыльцы березы названы Берполом, из пыльцы тимофеевки — Тимполом, из пыльцы полыни — Полполом. Пыльца этих растений вызывает в средней полосе России наиболее распространенные сезонные аллергические заболевания.