Модельные системы на основе метода культуры клеток in vitro

25.10.2015

Модельные системы, основанные на методах культивирования клеток in vitro, характеризуются высокой степенью требовательности к условиям их постановки. Они включают использование специального нейтрального стекла, многокомпонентных стерильных питательных сред, забуференных солевыми сбалансированными растворами и приготовленными на высокоочищенной деионизированной воде, моющих средствах специального состава, строгих правил асептики, боксов специальной конструкции с ламинарным потоком стерильного воздуха, строгое термостатирование клеточных культур при заданных температурных режимах, концентрации CO, в воздухе (5%) и пр. В силу этого работы в модельных системах, связанных с культивированием клеток in vitro, строго регламентируются, исключая возможность использования неоправданных дорогостоящих затрат. Так, например, среда №199 (Паркера), используемая на первичных этапах приготовления клеточных культур, включает 53 компонента (высокоочищенные аминокислоты, витамины, гормоны, компоненты нуклеиновых кислот, антибиотики, неорганические соли и др.). Среды, используемые в более продолжительных культуральных работах, характеризуются более сложным составом. Среда №858 состоит из 56, среда NCTC 107 — из 71 компонентов. Помимо этого, питательные среды включают одну из прописей солевых сбалансированных растворов неорганических солей — Хэнкса, Эрла, Тироде и др. Одной из наиболее широко используемых в настоящее время синтетических питательных сред для клеточных культур является среда RPMI-1640.
Серьезное ограничение широкого использования модельных систем in vitro заключается также в быстром отмирании клеток кроветворной и лимфоидной систем, несмотря на создание высококачественных питательных сред. В связи с этим зачастую возникает необходимость во включении в состав синтетических питательных сред различных, тщательно проверенных на токсичность, сывороток, в частности эмбриональной телячьей, сыворотки лошади, человека и др. В исследованиях, не требующих использования сред строго известного состава, используют питательные растворы, полностью состоящие из различных естественных компонентов в разных соотношениях — коровьей амниотической жидкости, куриного эмбрионального экстракта, лошадиной сыворотки, сыворотки обезьян, человека и др.
Вместе с тем, несмотря на указанные ограничения, исследование закономерностей иммунологических реакций, вскрытых в условиях культивирования клеток системы иммунитета in vitro, внесло существенный вклад в развитие иммунологии, инвитровые модельные системы успешно используются и в наши дни, К их числу можно отнести реакцию бласттрансформации лимфоцитов, систему индукции выработки антител in vitro, систему получения моноклональных антител и др.
Модельная система индукции выработки антител in vitro
До середины 60-х годов прошлого века все попытки индуцировать образование антител in vitro неиммунными клетками оканчивались неудачей, продукция антител воспроизводилась только при использовании клеток, сенсибилизированных однократно или повторно антигеном в организме донора. Первые успешные результаты по индукции образования антител в закрытом сосуде были получены Е.Е. Capalbo, J.F. Albright и W.E. Bennett в 1964 г. Авторы культивировали клетки селезенки неиммунных мышей в смеси с эритроцитами барана в диффузионных камерах, через 7 сут. в камерах и в сыворотке отдельных реципиентов выявлялись гемагглютинины и гемолизины с антиэритроцитарной активностью. Два года спустя, в 1966 г., R.I. Mishell и R.W. Dutton разработали более совершенный вариант модельной системы по индукции выработки антител вне организма и в 1967 г. его оптимизировали.
Для индукции выработки антител in vitro в чашки Петри диаметром 35 мм помещают 1 мл взвеси клеток селезенки (1,5'10в7) неиммунных мышей (использовали мышей B6D2F1) в смеси с 30 мкл 1%-ной суспензии (3'10в6) эритроцитов барана. Чашки Петри помещают в специальных боксах на качалки (скорость качания — 7-10 полных циклов «вперед-назад» за 1 мин.) и культивируют при 37°С 4-5 дней в атмосфере 7% О2, 10% CO, и 83% N2. Питательная среда, стерилизованная пропусканием через стерильные миллипоровые фильтры типа GS-1 мл среды Игла на солевом сбалансированном растворе без бикарбоната натрия с буферной системой Зеренсена, содержащей незаменимые аминокислоты, 1 мл 100-кратного концентрата среды Игла, содержащего заменимые аминокислоты, 0,2 мМ глутаминовой кислоты, 100 мМ пирувата натрия и 5% фетальной телячьей сыворотки. pH среды 7,2, устанавливали с помощью 1 N NaOH. Культуральную среду ежедневно подпитывают 75-100 мкл питательной смеси и 30 мкл телячьей бычьей сыворотки. После окончания культивирования собирают клетки в пробирку из 2-3 чашек, клетки осаждают центрифугированием при 4°С (250 g, 10 мин.) и в полученной взвеси определяют число AOK методом N.K. Jerne, KR Nordin (рис. 18.3) в перерасчете на 10в6 клеток, в культуральной жидкости — титры антиэритроцитарных антител (log2). По сравнению с контрольной культурой (культивирование клеток без эритроцитов) в опытной прирост AOK составлял до 100%, титры антител — от 4 до 6. Наиболее сильный антительный ответ регистрируется при извлечении селезенки от доноров, предварительно, иммунизированных (за 4 сут. до извлечения селезенки) эритроцитарными антигенами.
При разработке системы in vitro обнаружена способность эритроцитов барана из разных источников оказывать высокое или низкое стимулирующее действие. В связи с этим эритроциты были обозначены как H (High stimulation) и L (Low stimulation) соответственно. Оказалось, однако, что такой эффект эритроциты проявляют только в культуре in vitro, но не в культуре in vivo.
Анализ показал, что в системе in vitro продукция антител может быть индуцирована не только эритроцитами барана, но и эритроцитами из других источников — эритроцитами козла, осла, крупного рогатого скота, лошади, свиньи и кролика, но не собаки, кошки или хорька.
Модельные системы, основанные на реакции бласттрансформации лимфоцитов
Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) характеризует активирующее действие антигенов на лимфоциты, проявляющееся в увеличении размеров клетки, изменении ее морфологии, усилении синтеза макромолекул — РНК, ДНК и белка как показателей пролиферативной активности стимулируемых мононуклеаров. Показана корреляция между РБТЛ и другими феноменами клеточного иммунитета (гиперчувствительность замедленного типа - ГЗТ). Помимо антигенов способностью активировать лимфоциты, индуцировать синтез макромолекул и пролиферацию клеток обладают различные митогены разного происхождения (растительные, микробные, грибковые и др.). Действие отдельных из них на T-, В- или T- и В-лимфоциты человека и мышей показано в табл. 18.4.
Процессы активации лимфоцитов антигенами или митогенами лежат в основе как качественной, так и количественной оценки параметров реакции, характеризующейся спектром модификаций. Одни из этих модификаций направлены на оценку функциональной активности лимфоцитов конкретной особи при определении показателей ее иммунного статуса. Для этих целей обычно используют фитогемагглтотинин — ФГА, конканавалин А — КонА, ли-пополисахарид — ЛПС и др, (см. табл. 18.4). Другие — на оценку совместимости тканей разных особей и характеристику антигенов, контролируемых главным комплексом гистосовместимости, В этом случае основной критерий — выраженность реакции в смешанной культуре лимфоцитов — СКЛ или MLC (Mixed Lymphocyte Culture).

Модельные системы на основе метода культуры клеток in vitro

Как в одном, так и в другом случае, выраженность РБТЛ тестируют двумя, принципиально разными способами. Один из них предполагает оценку интенсификации синтеза ДНК (по включению в клетки тимидина, меченного тритием) или, например, белка (по включению в клетки С14-L-лейцина). Другой — изучение морфологических превращений клетки и анализ сопровождающих их процессов, определение числа образованных бластов. Как в одном, так и в другом случае, обычно ведется количественный учет реакции. Микроскопический учет реакции по морфологическим критериям менее точен по сравнению с изотопным методом.
Бласттрансформация лимфоцитов под влиянием митогенов
В конце 50-х годов прошлого столетия впервые было показано, что при культивировании лейкоцитов in vitro в присутствии ФГА появляются большие пиронинофильные клетки, сходные с плазмобластами. Впоследствии оказалось, что РБТЛ осуществляют Т-лимфоциты.
Реакцию обычно проводят в пластиковых крутлодонных планшетах для микрокультивирования в объеме 200 мкл среды, содержащей, в зависимости от используемого источника ткани, 2,5'10в5-5'10в6/мл клеток в смеси с 20 мкл антигена (митогена). Оптимальная концентрация большинства антигенов — 10-500 мкг/мл. После приготовления реакционной смеси, планшеты закрывают негерметичными крышками и помещают в СО2-термостат (5% CO2 в воздухе) при 37°С на 2-4 дня (пик пролиферации клеток в зависимости от используемого антигена). Для оценки интенсивности пролиферации клеток и образования ими бластных форм, за 16-24 час. до окончания культивирования в лунки планшетов вносят по 2 мкКи тимидина, меченного тритием (3Н-тимидин). Затем содержимое каждой из лунок переносят на специальные фильтры, высушивают их, клетки отмывают растворами хлористого натрия, трихлоруксусной кислоты и метанолом, фильтры вновь высушивают и помещают в сцинтилляционные флаконы, содержащие 10 мл сцинтилляционной жидкости. Интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток определяют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. По разнице в числе импульсов в опытных и контрольных (культивирование клеток без митогена) образцах судят о функциональной активности лимфоцитов. Индекс стимуляции (ИС) клеточной пролиферации определяют путем деления средних значений числа импульсов в трех опытных образцах на число импульсов в трех контрольных.
Параметры ИС обычно используют в качестве критерия функциональной активности T- и/или В-лимфоцитов под влиянием различных изучаемых факторов биологической, химической или физической природы.
Бласттрансформация в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ)
В 1964 г. В. Bain, M.R. Vas и L. Lovenstein впервые показали, что при совместном культивировании in vitro лимфоцитов двух неродственных лиц в культуре наблюдается трансформация клеток в бласты. Реакция была подобна той, которая регистрировалась при культивировании лимфоцитов с ФГА. Установление коррелятивных связей между выраженностью СКЛ и различиями по трансплантационным антигенам обусловили интенсивное использование модельной системы и оптимизацию условий ее постановки.
Принципиальные отличия СКЛ от РБТЛ, индуцированной митогенами, заключаются в замене митогена лимфоцитами (обычное соотношение культивируемых лимфоцитов двух генотипов — 1:1) и в более продолжительном культивировании планшетов в СО2-термостате — 5-7 дней. Учет результатов реакции в СКЛ также проводится по включению в ДНК клеток тимидина, меченного тритием. Установлено, что в СКЛ отвечающими клетками являются Т-лимфоциты, стимулирующими В-лимфоциты. Поскольку реакция нефракционированных клеток в СКЛ характеризуется двунаправленностыо (как в сторону клеток одного донора, так и другого), разработан вариант однонаправленной СКЛ. В этом случае лимфоциты одного из доноров облучают в дозе 3300 P или обрабатывают митомицином С (16 мкг/10в6 лимфоцитов). Такие лимфоциты сохраняют стимулирующую активность, но утрачивают способность трансформироваться в бластные формы и пролиферировать. В связи с этим РБТЛ характеризует функциональную активность лимфоцитов только одного из доноров. Однонаправленная реакция в СКЛ может быть индуцирована также в результате культивирования клеток гибридных животных (стимулирующие лимфоциты) в смеси с лимфоцитами родительской линии (отвечающие лимфоциты) (генетическая модель однонаправленной СКЛ).
При использовании лимфоцитов, выделенных от сенсибилизированных аллоантигенами доноров, в культуре in vitro развивается цитотоксическая реакция лимфоцитов против клеток, экспрессирующих эпитопы сенсибилизирующих аллоантигенов.
В заключение следует отметить, что разработка новых иммунологических проблем основывается как на использовании хорошо отработанных и оптимизированных имеющихся модельных систем, так и на создании новых, принципиально отличающихся от уже известных. Примером может служить система двойного распознавания, моделирующая один из важнейших этапов индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Одновременно с разработкой и совершенствованием новых модельных систем, прилагаются большие усилия для совершенствования имеющихся и создания новых методов оценки реакций и изучения механизмов иммунитета. Такими примерами может служить разработка методов выделения клеточных субпопуляций из взвеси лейкоцитов с помощью их центрифугирования в градиенте плотности различных реагентов; изучения антигенов главного комплекса гистосовместимости с помощью ДНК-типирования клеток; оценка параметров иммунного статуса с помощью лазерной проточной фотометрии и др. Разработаны такие высокочувствительные методические приемы, как радиоаллергосорентный тест (РАСТ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод иммуноферментного анализа (ИФА) и др.
Важный вклад в создание новых модельных систем для целей иммунологии, в разработку новых иммунологических методов и в создание новых профилактических, диагностических и лечебных препаратов и реагентов вносит иммунобиотехнология.