Новости
19.04.2024
19.04.2024
18.04.2024
|
Модельные системы на основе метода культуры клеток in vitro25.10.2015
Модельные системы, основанные на методах культивирования клеток in vitro, характеризуются высокой степенью требовательности к условиям их постановки. Они включают использование специального нейтрального стекла, многокомпонентных стерильных питательных сред, забуференных солевыми сбалансированными растворами и приготовленными на высокоочищенной деионизированной воде, моющих средствах специального состава, строгих правил асептики, боксов специальной конструкции с ламинарным потоком стерильного воздуха, строгое термостатирование клеточных культур при заданных температурных режимах, концентрации CO, в воздухе (5%) и пр. В силу этого работы в модельных системах, связанных с культивированием клеток in vitro, строго регламентируются, исключая возможность использования неоправданных дорогостоящих затрат. Так, например, среда №199 (Паркера), используемая на первичных этапах приготовления клеточных культур, включает 53 компонента (высокоочищенные аминокислоты, витамины, гормоны, компоненты нуклеиновых кислот, антибиотики, неорганические соли и др.). Среды, используемые в более продолжительных культуральных работах, характеризуются более сложным составом. Среда №858 состоит из 56, среда NCTC 107 — из 71 компонентов. Помимо этого, питательные среды включают одну из прописей солевых сбалансированных растворов неорганических солей — Хэнкса, Эрла, Тироде и др. Одной из наиболее широко используемых в настоящее время синтетических питательных сред для клеточных культур является среда RPMI-1640. Как в одном, так и в другом случае, выраженность РБТЛ тестируют двумя, принципиально разными способами. Один из них предполагает оценку интенсификации синтеза ДНК (по включению в клетки тимидина, меченного тритием) или, например, белка (по включению в клетки С14-L-лейцина). Другой — изучение морфологических превращений клетки и анализ сопровождающих их процессов, определение числа образованных бластов. Как в одном, так и в другом случае, обычно ведется количественный учет реакции. Микроскопический учет реакции по морфологическим критериям менее точен по сравнению с изотопным методом. Бласттрансформация лимфоцитов под влиянием митогенов В конце 50-х годов прошлого столетия впервые было показано, что при культивировании лейкоцитов in vitro в присутствии ФГА появляются большие пиронинофильные клетки, сходные с плазмобластами. Впоследствии оказалось, что РБТЛ осуществляют Т-лимфоциты. Реакцию обычно проводят в пластиковых крутлодонных планшетах для микрокультивирования в объеме 200 мкл среды, содержащей, в зависимости от используемого источника ткани, 2,5'10в5-5'10в6/мл клеток в смеси с 20 мкл антигена (митогена). Оптимальная концентрация большинства антигенов — 10-500 мкг/мл. После приготовления реакционной смеси, планшеты закрывают негерметичными крышками и помещают в СО2-термостат (5% CO2 в воздухе) при 37°С на 2-4 дня (пик пролиферации клеток в зависимости от используемого антигена). Для оценки интенсивности пролиферации клеток и образования ими бластных форм, за 16-24 час. до окончания культивирования в лунки планшетов вносят по 2 мкКи тимидина, меченного тритием (3Н-тимидин). Затем содержимое каждой из лунок переносят на специальные фильтры, высушивают их, клетки отмывают растворами хлористого натрия, трихлоруксусной кислоты и метанолом, фильтры вновь высушивают и помещают в сцинтилляционные флаконы, содержащие 10 мл сцинтилляционной жидкости. Интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток определяют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. По разнице в числе импульсов в опытных и контрольных (культивирование клеток без митогена) образцах судят о функциональной активности лимфоцитов. Индекс стимуляции (ИС) клеточной пролиферации определяют путем деления средних значений числа импульсов в трех опытных образцах на число импульсов в трех контрольных. Параметры ИС обычно используют в качестве критерия функциональной активности T- и/или В-лимфоцитов под влиянием различных изучаемых факторов биологической, химической или физической природы. Бласттрансформация в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) В 1964 г. В. Bain, M.R. Vas и L. Lovenstein впервые показали, что при совместном культивировании in vitro лимфоцитов двух неродственных лиц в культуре наблюдается трансформация клеток в бласты. Реакция была подобна той, которая регистрировалась при культивировании лимфоцитов с ФГА. Установление коррелятивных связей между выраженностью СКЛ и различиями по трансплантационным антигенам обусловили интенсивное использование модельной системы и оптимизацию условий ее постановки. Принципиальные отличия СКЛ от РБТЛ, индуцированной митогенами, заключаются в замене митогена лимфоцитами (обычное соотношение культивируемых лимфоцитов двух генотипов — 1:1) и в более продолжительном культивировании планшетов в СО2-термостате — 5-7 дней. Учет результатов реакции в СКЛ также проводится по включению в ДНК клеток тимидина, меченного тритием. Установлено, что в СКЛ отвечающими клетками являются Т-лимфоциты, стимулирующими В-лимфоциты. Поскольку реакция нефракционированных клеток в СКЛ характеризуется двунаправленностыо (как в сторону клеток одного донора, так и другого), разработан вариант однонаправленной СКЛ. В этом случае лимфоциты одного из доноров облучают в дозе 3300 P или обрабатывают митомицином С (16 мкг/10в6 лимфоцитов). Такие лимфоциты сохраняют стимулирующую активность, но утрачивают способность трансформироваться в бластные формы и пролиферировать. В связи с этим РБТЛ характеризует функциональную активность лимфоцитов только одного из доноров. Однонаправленная реакция в СКЛ может быть индуцирована также в результате культивирования клеток гибридных животных (стимулирующие лимфоциты) в смеси с лимфоцитами родительской линии (отвечающие лимфоциты) (генетическая модель однонаправленной СКЛ). При использовании лимфоцитов, выделенных от сенсибилизированных аллоантигенами доноров, в культуре in vitro развивается цитотоксическая реакция лимфоцитов против клеток, экспрессирующих эпитопы сенсибилизирующих аллоантигенов. В заключение следует отметить, что разработка новых иммунологических проблем основывается как на использовании хорошо отработанных и оптимизированных имеющихся модельных систем, так и на создании новых, принципиально отличающихся от уже известных. Примером может служить система двойного распознавания, моделирующая один из важнейших этапов индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Одновременно с разработкой и совершенствованием новых модельных систем, прилагаются большие усилия для совершенствования имеющихся и создания новых методов оценки реакций и изучения механизмов иммунитета. Такими примерами может служить разработка методов выделения клеточных субпопуляций из взвеси лейкоцитов с помощью их центрифугирования в градиенте плотности различных реагентов; изучения антигенов главного комплекса гистосовместимости с помощью ДНК-типирования клеток; оценка параметров иммунного статуса с помощью лазерной проточной фотометрии и др. Разработаны такие высокочувствительные методические приемы, как радиоаллергосорентный тест (РАСТ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод иммуноферментного анализа (ИФА) и др. Важный вклад в создание новых модельных систем для целей иммунологии, в разработку новых иммунологических методов и в создание новых профилактических, диагностических и лечебных препаратов и реагентов вносит иммунобиотехнология.
|