Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

25.10.2015

Модельная система по изучению численности в тканях и функций стволовых кроветворных клеток
Основные этапы культивирования клеток: извлечение изучаемой ткани (обычно вымывание костного мозга из бедренной и большой берцовой кости или извлечение селезенки) (1); приготовление взвеси клеток и их подсчет (2); внутривенная трансплантация клеток летально облученным реципиентам (через 4-24 часа после облучения, обычно в дозе 850-950 Р) (3); извлечение селезенки и учет результатов — подсчет числа стволовых кроветворных клеток по количеству формируемых ими колоний (4) через 7-8 (подсчет числа «ранних» колоний) — 10-12 суток после трансплантации клеток (подсчет числа «поздних» колоний) или определение характера дифференцировки стволовых кроветворных клеток на серийных парафинированных срезах селезенки (5).
Этап учета результатов функционирования экзогенно введенных стволовых клеток (рис. 18.7) — подсчет числа КОЕ — принципиально ничем не отличается от системы подсчета числа эндогенных стволовых клеток (рис. 18.2) но числу формируемых ими КОЕ.

Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

При определении действия различных факторов на стволовые кроветворные клетки (КОЕ) факторные воздействия могут осуществляться в организме донора в разные сроки до извлечения клеток, in vitro или в организме реципиента в различные сроки после трансплантации клеточной взвеси.
Модельная система по изучению в культуре клеток in vivo закономерностей гуморального иммунитета и его регуляции факторами биологической, физической или химической природы
Модельная система по изучению закономерностей гуморального иммунитета в норме и при действии различных факторов разработана PB, Петровым и В.М Манько, базируется на системе Т. Makinodan (см. рис. 18.6). В разработке модели активное участие принял Э.И. Пантелеев. Система включает линии животных, оппозитно реагирующих на используемый антиген — C57BL/6J (высокоотвечающие) и C3H/HeDiSn (низкоотвечающие) — на бактерии L. Canicola; CBA (высокоотвечающие) и C57BL/6J (низкоотвечающие) — на эритроциты барана; BALB/c (высокоотвечающие) и C57BL/6J (низкоотвечающие) — на очищенный а-анатоксин Cl. perfringens; СЗН (высокоотвечающие) и DBA/2 (низкоотвечающие) — на α-анатоксин Cl. oedematiens; BALB/c, А/Не и CBA (вышкоотвечающие) и CC57BR и C57BL/6I (низкоотвечающие) — на конъюгат 2,4-динитрофенил — бычий γ-глобулин (ДНФ48ВГГ) и т.д. При однотипности ответа на то или иное факторное воздействие оппозитно реагирующих на антиген иммуноцитов разных генотипов исключается возможность нсспецифического реагирования животного на воздействие, обусловленного особенностями его генотипа. Совершенно очевидно, что такое тестирование предполагает воспроизведение оппозитности реагирования на антиген в культуре in vivo, регистрируемое на уровне целого организма.
Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

Модельная система по изучению в культуре клеток in vivo процессов взаимодействия T- и В-лимфоцитов
Сингенные клетки костного мозга и тимуса, порознь (1, 2) или в смеси (3), вместе с антигеном (эритроциты барана) внутривенно трансплантируют сингенным реципиентам через 4-24 ч после их облучения в летальной дозе (рис. 18.8). Через 7 сут. реципиентов убивают, извлекают селезенки и после их гомогенизации определяют число AOK методом N.K. Jerne, RF. Nordin, 1963 (см. рис. 18.3). Совместная трансплантация В- (источник — костный мозг) и Т-лимфоцитов (источник — тимус) ареактивным реципиентам сопровождается их кооперативным взаимодействием, определяющим существенно большее накопление продуцентов антител в селезенке реципиентов (3), по сравнению с суммой AOK раздельно трансплантируемых клеточных взвесей (1+2).
Модельная система по изучению в культуре in vitro взаимодействия клеток в продуктивный период иммунного ответа
Культивирование в течение 18 час. in vitro клеток лимфатических узлов, извлеченных на 4 сутки после повторной иммунизации мышей ЭБ или ГГЛ, в смеси с клетками костного мозга интактных сингенных мышей сопровождается увеличением продукции вырабатываемых антител в 2,5-4,3 раза по сравнению с продукцией антител только клетками лимфатических узлов (рис. 18.9). Усиление продукции антител клетками лимфатических узлов иммунных животных происходит под влиянием миелопептидов, вырабатываемых клетками костного мозга неиммунизированных животных.
Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

Под влиянием изучаемых факторов различной природы модельная система дает возможность вести анализ продукции миелопептидов клетками костного мозга, выработки антител клетками лимфатических узлов, взаимодействия клеток на уровне зрелых продуцентов антител.
Модельная система по изучению в культуре клеток in vivo закономерностей клеточного иммунитета и его регуляции факторами биологической, физической или химической природы
Модельная система базируется на явлении взаимодействия лимфоцитов со стволовыми кроветворными клетками, сопровождающемся инактивацией лимфоцитами генетически чужеродных и изменением направления дифференцировки генетически идентичных стволовых клеток, открытом PB. Петровым и Л.С. Сеславиной в 1970 г. (открытие зарегистрировано Государственным комитетом по делам изобретений и открытий в Государственном реестре открытий за №192 от 1 декабря 1977 г.). Принципиальная схема модельной системы показана на рис. 18.10.
Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

Мышам-гибридам (CBAxC57BL/6J)F1 или (C57BL/6JxCBA)F1 через 4-24 час. после облучения в летальной дозе (850-900 P) внутривенно трансплантируют клетки костного мозг а (источник КСК) мышей линии C57BL/6J только (контроль) или в смеси с клетками лимфатических узлов (источник Т-лимфоцитов) мышей линии CBA (опыт). Через 7-8 сут. после трансплантации клеток реципиентов обеих групп убивают, извлекают селезенки и после их фиксации в жидкости Буэна подсчитывают число видимых на глаз колоний, формируемых стволовыми кроветворными клетками. В процессе культивирования смеси клеток in vivo Т-лимфоциты мышей линии CBA инактивируют стволовые клетки мышей линии C57BL/6J, в селезенках опытной группы регистрируется существенно меньше колоний (или таковые отсутствуют) по сравнению с селезенками контрольной группы. Анализ колоний на серийных срезах селезенки свидетельствует об инактивации Т-лимфоцитами всех ростков кроветворения. Различия в числе колоний, выраженные в процентах, свидетельствуют об интенсивности реакций клеточного иммунитета, изучаемого в различных вариантах опыта (использование субпопуляций клеток или воздействие различных факторов на стволовые клетки, на лимфоциты или на процессы взаимодействия лимфоцитов со стволовыми клетками) на уровне центральных клеток иммунитета (Т-лимфоциты) и кроветворения (стволовые кроветворные клетки).
Использование культуры клеток in vivo для изучения особенностей взаимодействия Т-лимфоцитов с сингенными стволовыми кроветворными клетками
Летально облученным реципиентам (CBAxC57BL/6J)F1 внутривенно трансплантируют только клетки костного мозга мышей линии CBA (контроль) или смесь сингенных клеток костного мозга и лимфатических узлов (мыши линии СВА) — опыт. Через 7-8 сут. после трансплантации клеток реципиентов убивают, извлекают селезенки, готовят серийные парафинированные срезы и после их окрашивания считают число кроветворных колоний разных типов. По сравнению с контрольными животными в опытной группе под влиянием антигенно стимулированных (со стороны гибридов F1) лимфоцитов направление дифференцировки сингенных стволовых клеток изменяется с преимущественно эритроидного на преимущественно миелоидный путь созревания клеток-предшественников — отношение Э/Г падает в зависимости от соотношения костномозговых и лимфоидных клеток с 1,8-2,0 до 0,1-0,02 или ниже. При этом размер колоний изменяется таким образом, что подсчет их количества становится возможным только под микроскопом.
Модельная система с использованием сингенной смеси трансплантируемых клеток дает возможность изучения действия различных факторов не только на процессы пролиферации стволовых кроветворных клеток, но и на характер их дифференцировки — в направлении эритро- или миелопоэза.
Модельная система по изучению в культуре in vivo клеточного иммунитета на уровне взаимодействия лейкоцитов разных видов животных со стволовыми кроветворными клетками мышей
Летально облученным реципиентам (CBAxC57BL/6J)F1 внутривенно трансплантируют только клетки костного мозга мышей линии C57BL/6J (контроль) или клетки костного мозга мышей линии C57BL/6J в смеси с лейкоцитами разных видов животных, в т.ч. крупных (опыт). Через 7-9 сут. после трансплантации клеток реципиентов убивают, извлекают селезенки и после их фиксации в р-ре Буэна визуально или под микроскопом на серийных срезах подсчитывают в обеих группах число колоний кроветворных клеток. По разнице в числе колоний между подопытной и контрольной группами судят о функциональной активности эффекторных клеток, обеспечивающих инактивацию процессов пролиферации и дифференцировки генетически чужеродных стволовых клеток. Установлено, что функции пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток подвергаются инактивирующему действию лейкоцитов крыс, морских свинок, кур, овец, собак, человека.
Модельная система по изучению в культуре клеток in vivo особенностей клеточного иммунитета, развивающегося вне кроветворной и лимфоидной систем
Мышам гибридам (CBAxC57BL/6J)F1 под гексеналовым наркозом имплантируют в брюшную полость искусственную основу — миллипоровые фильтры «Synpor» диаметром ~2 см. Через 5-10 дн. (время, достаточное для покрытия основы перитонеальными клетками) мышей облучают в летальной дозе (850-900 P) и через 3-5 час. после этого внутрибрюшинно вводят только клетки костного мозга мышей линии C57BL/6J (контроль) или клетки костного мозга мышей линии C57BLZ6J в смеси с лимфоцитами лимфатических узлов мышей линии CBA (опыт). Через 7-8 сут. после трансплантации клеток мышей убивают, извлекают имплантированный фильтр и после окрашивания тотальных препаратов гематоксилином Эрлиха и стандартных этапов гистологической обработки считают количество кластеров (скопление 5-50 дифференцированных клеток) и очагов кроветворения (скопление большего количества клеток) на препаратах обеих групп реципиентов. По разнице в количестве кластеров и очагов кроветворения в опытной группе по сравнению с контрольной судят об эффекторной активности Т-лимфоцитов.
Модельная система обеспечивает возможность культивирования кроветворных клеток в перитонеальной полости летально облученных реципиентов на искусственно созданном подслое перитонеальных клеток (фибробластов и макрофагов). Такой клеточный полислой лишен сосудистой сети и пространственной организации, характерной для кроветворных органов. Формируемые очаги кроветворения на подслое перитонеальных клеток характеризуются гранулоцитарным типом дифференцировки клеток-предшественников. Взаимодействие Т-лимфоцитов (CBA) с генетически чужеродными кроветворными клетками-предшественниками (C57BL/6J) сопровождается резким угнетением функций последних в ближайшие сроки после трансплантации клеточной смеси — на 2 сут, инактивируется около 80% кластеров и очагов кроветворения, их 100%-ная инактивация наблюдается на 7 сут. после трансплантации.
Модельная система предусматривает возможность изучения функций разных популяций клеток системы иммунитета так же, как их исследование под влиянием различных факторов биологической, физической или химической природы.
Модельные системы по изучению в культуре in vivo механизмов гуморального и клеточного иммунитета

Модельная система по изучению особенностей клеточного иммунитета, развивающегося на хориоалпантоисной мембране куриных эмбрионов
На хориоаллантоисную мембрану 10-11-дневных куриных эмбрионов трансплантируют сингенные лимфоциты взрослых кур в смеси с аллогенными гемопоэтически ми клетками — опытная группа. В контрольных группах опыта на хориоаллантоисную мембрану трансплантируют только гемопоэтические клетки. Взаимодействуя с генетически чужеродными гемопоэтическими клетками, лимфоциты подавляют их функциональную активность. Это дает возможность характеризовать активность лимфоцитов при разных иммунозависимых патологических состояниях или при различных воздействиях, определяющих функциональную активность не только лимфоцитов, но и гемопоэтических клеток-предшественников.
Модельная система культуры in vivo по одновременной характеристике клеток в реакциях гуморального и клеточного иммунитета
Модельная система разработана RB. Петровым, Д.С. Сеславиной и Э.И. Пантелеевым, модифицирована В.М. Манько и др.
Легально облученным реципиентам (CRAxC57BL/6J)F1 внутривенно трансплантируют клетки селезенки интактных или иммунизированных эритроцитами барана мышей линии C57BL/6J в смеси с эритроцитами барана (контроль) или клетки селезенки интактных или иммунизированных эритроцитами барана мышей линии C57BL/6J в смеси с лимфоцитами лимфатических узлов мышей линии CBA и эритроцитами барана (опыт). Через 7 сут. после трансплантации клеток реципиентов убивают, извлекают селезенки и готовят взвесь клеток для определения численности антителообразующих клеток (AOK) методом N.K. Jerne, RF. Nordin. Другую часть извлеченных селезенок используют для приготовления замороженных серийных срезов селезенки, необходимых для определения числа клеток-предшественников продуцентов антител (ФОК) методом J.C. Kennedi, J.E. Till, L, Siminovilch и Е.А, McCulloch (рис. 18.3).
Взаимодействуя с генетически чужеродными (C57BL/6J) клетками-предшественниками продуцентов антител лимфоциты мышей линии CBA инактивируют их. В селезенках реципиентов опытной группы по сравнению с контрольной регистрируется существенно меньше AOK и ФОК — при первичном ответе на 50-70%, при вторичном — > 96%. Таким образом, подсчет в модельной системе числа антителообразующих клеток и клеток-предшественников продуцентов антител при первичном и вторичном антительном ответе на антигенное раздражение и учет снижения их численности под влиянием аллогенных лимфоцитов позволяет одновременно характеризовать реакции как гуморального, так и клеточного иммунитета, вести анализ факторов, влияющих на развивающиеся реакции.