Линейные животные

25.10.2015

В отличие от рандомбредных (беспородных, случайно скрещиваемых) линейных животных получают в результате близкородственного разведения — преимущественно братско-сестринского скрещивания, на протяжении не менее 20 последовательных поколений и искусственного отбора (возможны также скрещивания по типу отец-дочь или мать-сын, однако они менее удобны из-за возрастных ограничений). По представлениям видного отечественного генетика, одного из основателей производства линейных мышей в России, Н.Н. Медведева для достижения высокой степени гомозигогности (генетической тождественности) линия должна пройти 40 поколений инбридинга. Полученную линию животных называют чистой линией, а животных этой линии — чистолинейными (синонимы: линейные, инбредные, высокоинбредные животные). Таким образом, чистая линия — это ограниченная совокупность животных, размножающихся путем близкородственных скрещиваний (братско-сестринских или родителей с детьми при условии, что последние скрещиваются с более молодыми из родителей) на протяжении не менее 20 последовательных поколений.
В случае разделения линии и поддержания ее отводки в других коллективах или даже континентах возможно возникновение наследственных изменений (мутаций), которые способствуют генетической дивергенции (расхождению) отдельной ветви исходной линии. Мутации, накапливающиеся при длительном размножении, приводят к биологическим отличиям этой ветви от основной линии и к возникновению сублинии. Сублинией называют линию, представляющую собою ветвь основной формируемой или сформированной линии, животные которой размножались в новых лабораторных или производственных условиях на протяжении не менее 12 последовательных поколений братско-сестринских скрещиваний. Обычно такие животные отделяются от животных уже сформированной линии в качестве племенного материала или отделяются от животных формируемой линии на уровне прошедших 8-19 поколений инбридинга. Наименование сублинии обозначается в виде одной, двух или трех первых букв фамилии автора или названия лаборатории, в которой поддерживается данная сублиния. Буквенные обозначения следуют за дробной чертой, проставляемой после обозначения основной линии. Например обозначение мышей C3H/HeWi означает, что сублиния С3Н/ HeWi мышей линии С3Н поддерживается Уилсоном (Wilson — Wi), который получил ее от Хестона (Heston — He).
В табл. 18.1 приведена характеристика линий и сублиний мышей, наиболее часто используемых в экспериментальных исследованиях в России.

Линейные животные
Линейные животные
Линейные животные

Для исследовательских целей и решения различных иммуногенетических задач фундаментального и прикладного характера выведены специальные линии мышей, которые включают коизогенные, конгенные, конгенно-резистентные и трансгенные линии.
Коизогенные линии — генетически идентичные инбредные линии, различающиеся только по одному локусу. Источником их выведения являются животные с единичной мутацией в данном локусе. Для искусственного получения таких животных вводят ген одной линии (донорская линия) на генетическую основу другой линии (инбредный партнер) с помощью последовательных возвратных скрещиваний. Получаемую линию, не достигшую коизогенности, называют кошенной. Конгенную линию и ее инбредного партнера называют конгенной парой. Контенные линии мышей обозначают через точку символами конгенной пары. Так, обозначение конгенной линии B10.D2 означает, что она происходит от основной линии C57BL/10 (инбредный партнер, символ В10) и донорской линии DBA/2 (символ D2). Другой пример — конгенная линия В6.С получена при использовании инбредного партнера C57BL/6 (символ В6) и донорской линии BALB/c (символ С). Большинство кошенных линий мышей выведено американским ученым Нобелевским лауреатом Г. Снеллом (G.D. Snell) для изучения генов и их продуктов, контролируемых главным комплексом гистосовместимости.
Конгенные линии, отличающиеся по локусу тканевой совместимости и взаимно резистентные к тканевому трансплантату друг друга, называют конгенно-резистентными линиями. Пару таких линий называют конгенно-резистентной парой.
Трансгенные мыши — животные с введенным в геном искомым посторонним геном. Таких животных получают в результате индукции суперовуляции введением самке фолликулинстимулирующего гормона и хорионического гонадотропина, спаривания самки с самцом, извлечения оплодотворенной яйцеклетки, введения в нее нескольких сот копий ДНК экзогена и имплантации яйцеклетки в матку или в яйцеводы другой псевдобеременной самки.
В отдельных случаях, не требующих подробного описания используемых линий мышей, в частности, для обозначения гибридных животных или конгенных линий, приняты следующие сокращения стандартных широкораспространенных линий мышей:
Линейные животные

В соответствии с этим, например, гибриды (C3HxC57BL/10)F1 сокращенно обозначаются как C3B10F1.
Помимо инбредных мышей, в экспериментальных исследованиях нашли широкое применение отдельные линии крыс (August, Fischer, Lewis) и морских свинок (линии 2 и 13).
Наряду с указанными инбредными линиями в современной иммунологии все большее применение находят мыши с различными, как правило, рецессивными, мутациями, поддерживаемыми обычно в гетерозиготном состоянии (в связи с высокой чувствительностью к инфекциям, непродолжительностью жизни и высокой смертностью). Мутантные животные характеризуются широким спектром спонтанно развивающихся иммунозависимых патологических состояний, обусловленных различными иммунодефицитами. По сути дела, такие животные являются уникальным и практически незаменимым инструментом изучения интимных механизмов иммуногенеза. Характерным примером может служить сцепленная с Х-хромосомой рецессивная мутация sf (от scurfy — покрытый перхотью), описанная у мышей в 1959 г. В гомозиготном состоянии такие животные погибают через 3-4 нед. после рождения с явлениями анемии, тяжелой диареи, экземы. Мыши характеризуются низкорослостью. У них наблюдается гиперактивация лимфоцитов фенотипа CD4, развивается фатальный аутоиммунный лимфопролиферативный синдром с полиорганной лимфатической инфильтрацией. Анализ патологии на генетическом уровне выявил в 2001 г. (М. Brunkow и др.) связь мутации sf с геном foxp3, кодирующим фактор транскрипции FOXP3 — основной цитоплазматический маркер естественных регуляторных Т-клеток TReg с супрессорной активностью. Выявленная зависимость подтверждалась экспериментами, выполненными на трансгенных животных. Введение гена sf трансгенным мышам отменяло развитие заболевания. Таким образом, было установлено, что мутация конкретного гена, контролирующего супрессорную активность Т-лимфоцитов и ее ослабление, сопровождается развитием тяжелого аутоиммунного поражения. Нормализация функционирования мутировавшего гена отменяет развитие патологического процесса.
Сходная патологическая картина зарегистрирована у человека. Как оказалось, развитие человеческого синдрома IPEX (Immune dis regulat ion, Polyen-docrinopathy, Enteropathy X-Iinked syndrome), ранее известного как синдром XLAAD (X-Linked Autoimmunity-Allergic Dysregulation syndrome), также обусловлено мутацией сцепленного с Х-хромосомой гена fохр3. Иначе говоря, тяжелый иммунодефицит у человека в виде синдрома IPEX явился аналогом сходного синдрома у мышей, развитие которого также сопровождается тяжелым иммунодефицитом, индуцируемым мутацией гена sf.
Совершенно очевидно, что мыши с мутацией sf представляются уникальной модельной системой не только для изучения особенностей индукции и механизмов развития обнаруженного тяжелого иммунодефицита, но и для разработки подходов к диагностике, терапии и, возможно, профилактике IPEX-синдрома у человека, изучению возможного развития сходного синдрома у домашних животных,
В табл. 18.2 приведена характеристика иммунодефицитов и иммунозависимых патологий наиболее часто используемых мутантных мышей, указаны имеющиеся сведения о линиях мышей, на которых поддерживаются мутации в гетерозиготном состоянии.
Линейные животные
Линейные животные
Линейные животные

Подопытных животных содержат в специальных пластиковых или металлических (оптимально из нержавеющей стали) клетках с автоматическими поилками и кормушками без ограничений доступа к воде и пище в теплых, отапливаемых помещениях. Для подстилки используется деревянная стружка (хвойные деревья исключены). В связи с высокой чувствительностью к инфекциям линейных животных и особенно мутантных мышей помещения для работы с животными оборудуются специальными стерилизующими устройствами (ультрафиолетовое излучение), в экспериментальный отсек подается под давлением воздух, стерилизуемый пропусканием его через фильтры Петрянова, или работы проводятся в специализированных боксах с ламинарным потоком стерилизуемого воздуха. Экспериментальные работы проводятся в хирургических масках в условиях максимальной асептики. Используемые питательные среды и солевые сбалансированные растворы стерилизуются фильтрацией через стерильные миллипоровые фильтры. Халаты, шапочки, инструментарий, лабораторное стекло и пр. стерилизуются автоклавированием.
Для целей индивидуального динамического слежения и анализа изучаемых параметров, а также для предупреждения возможного смешивания животных разных подопытных групп уши мышей метят специальным пробойником или ножницами с загнутыми браншами и тупыми концами (рис. 18.1).
Линейные животные

Использование модельных систем организменного уровня предполагает решение по меньшей мере трех типов задач.
1. Использование интактных и иммунизированных линейных животных или мутантных мышей как таковых для изучения особенностей иммунологических реакций, развивающихся у таких животных в зависимости от их состояния (различные мутации, генетический нокаут, формирование опухолей различной локализации и реакция на их образование, ответ на иммунизацию разными антигенами, на трансплантацию тканей или органов, развитие иммунологических реакций в процессе онтогенеза и т.п.). Эти исследования могут включать также изучение продукции и аффинности антител, процесс фагоцитоза и его завершенность, характеристику дендритных клеток, применение электронной микроскопии, анализ гистологических препаратов и пр.
2. Использование линейных животных или мутантных мышей (интактных, иммунизированных, вакцинированных, инфицированных и т.п.) для изучения эффективности создаваемых иммунодиагностикумов, вакцин, иммуномодуляторов и других препаратов.
3. Использование линейных или мутантных мышей в качестве базовой основы для создания специальных модельных систем, необходимых для решения поставленных задач. Так, например, индуцированная реакция гиперчувствительности замедленного типа может служить удобной моделью для изучения функций разных субпопуляций иммуноцитов в реакциях клеточного иммунитета, исследования эффективности созданных активирующих реакцию и ее тормозящих препаратов и т.п. Количественные различия в продукции антител мышами разных линий на конкретный антиген применяются для создания иммуногенетических систем по изучению менделевского расщепления признака и выявлению генов, контролирующих иммунный ответ к используемым иммуногенам. Множественность таких примеров огромна. Несомненным является то, что линейные животные являются незаменимой модельной системой организменного уровня или компонентом такой системы, применяемых для исследования закономерностей функционирования системы иммунитета.
В качестве модельных систем организменного уровня, помимо линейных животных как таковых, наиболее широкое применение нашли системы, дающие возможность изучения количественных закономерностей пролиферации и дифференцировки эндогенных стволовых кроветворных клеток, гуморального иммунитета по числу антителообразующих клеток, анализа количественных закономерностей клеточного иммунитета по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Модельная система по определению процессов пролиферации и дифференцироваки эндогенных стволовых кроветворных клеток в селезенке мышей
Модельная система по анализу количественных закономерностей пролиферации и дифференцировки эндогенных стволовых кроветворных клеток (рис. 18.2) основывается на наблюдении, показавшем, что сублетальное облучение мышей сопровождается образованием в их селезенке видимых на глаз колоний клеток (42-55% эритроидных, 14-24% гранулоцитарных, 18-21% мегакариоцитарных, 16-21% смешанных), формируемых размножающимися и дифференцирующимися эндогенными стволовыми кроветворными клетками. Каждая отдельная колония образуется одной стволовой клеткой. Подсчет общего количества колоний, образуемых колониеобразующими единицами — КОЕ или CFU (Colony-forming units) — дает возможность количественного анализа действия различных факторов биологической, химической или физической природы на стволовые клетки. В зависимости от цели эксперимента факторы применяют в разные сроки до- или после сублетального облучения животных.
Линейные животные

Для подсчета числа стволовых клеток (КОЕ) мышей убивают дислокацией шейных позвонков через 7-9 суток после сублетального облучения, извлекают селезенки, фиксируют их в фиксаторе Буэна и визуально или при небольшом увеличении подсчитывают число колоний. Для определения характера дифференцировки стволовых кроветворных клеток готовят серийные парафинированные срезы селезенки и под микроскопом на фиксированных и окрашенных гистологических препаратах подсчитывают численность колоний клеток разных гистологических типов. Обычно высчитывают соотношение числа эритроидных и гранулоцитарных колоний, которое в норме составляет 2-3:1.
Модельная система по определению числа антителообразующих клеток и их предшественников в селезенке мышей
Иммунизация мышей эритроцитами барана сопровождается накоплением в селезенке животных клеток, образующих антиэритроцитарные антитела (гемолизины). Для подсчета числа антитело образующих клеток (AOK) (рис. 18.3) готовят смесь полужидкого агара Difco или агарозы в смеси с клетками селезенки и эритроцитами барана, которую заливают в чашки Петри (б) на подложку из застывшего агара (агарозы). После инкубирования при 37°С в течение 1 часа в каждую чашку добавляют комплемент (разведенная сыворотка морской свинки) и чашки вновь инкубируют 45 мин. при 37°С. Под влиянием секретируемых клетками гемолизинов и комплемента эритроциты лизируются в местах локализации отдельных АО К, После инкубирования чашек комплемент сливают и подсчитывают видимые на глаз (или под инвертированным микроскопом) зоны лизиса эритроцитов, соответствующие численности антителопродуцентов. Обычно определяют численность AOK в расчете на 10в6 ядросодержащих спленоцитов и в пересчете на всю селезенку.
Линейные животные

Описанным способом определяются клетки, вырабатывающие антитела класса IgM. Для подсчета продуцентов IgG в чашки Петри на агар наслаивают антисыворотку к IgG и затем комплемент. Дальнейший анализ ведут указанным выше способом.
Количество предшественников антителопродуцентов подсчитывается принципиально сходным образом, за исключением того, что в чашки Петри на застывший слой агара или агарозы в смеси с эритроцитами барана помещаются не клеточные взвеси, а серийные замороженные срезы селезенки иммунизированных эритроцитами животных (а). В этом случае лизис эритроцитов не-диссоциированными клетками свидетельствует о наличии предшественников продуцентов антител (фокусобразующие клетки — ФОК), численность которых также подсчитывается визуально или под инвертированным микроскопом.
Для определения активности факторов, влияющих на функции эффекторов гуморального иммунитета или их предшественников, их вводят животным до-, во время или после иммунизирующей инъекции антигена.
Модификация Каннингема определения численности продуцентов антител
На предметное стекло (25'75 мм) наклеивают три узкие полоски двусторонней липкой ленты (две по краям, одну посередине), разделяющие предметное стекло примерно на две равные половины (рис. 18.4). Затем на стекло плотно накладывают второе предметное стекло, под которым благодаря полоскам липкой ленты образуются две узкие камеры (щели) с общим объемом -180-200 мкл. С помощью пастеровской пипетки в камеры помещают смесь исследуемых лимфоидных клеток, эритроцитов барана (индикаторные эритроциты) и комплемента (на 100 мкл солевого сбалансированного раствора добавляют 50 мкл лимфоидных клеток, 20 мкл 8-10%-ной взвеси эритроцитов барана и 20 мкл комплемента). После этого камеры герметизируют, осторожно погружая края стекол в расплавленную смесь парафина и воска (1:1). Затем стекла инкубируют 1-2 час. при 37°С и под стереоскопическим микроскопом считают число зон гемолиза эритроцитов, образуемых под влиянием антител, секретируемых антителообразующими клетками, и комплемента.
Линейные животные

Модельная система по индукции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и ее выраженности у мышей
Реакция гиперчувствительности замедленного типа на антигены или гаптены, способные комплексироваться с белками собственного организма, развивается в два основных этапа — специфический и неспецифический. Специфический включает активацию Т-хелперов I типа (Th1) связавшими гаптен дендритными клетками, размножение Т-клеток фенотипа CD4 и секрецию ими цитокинов (ИНФ, ФНО, ИЛ-2 и др.). Под влиянием секретируемых цитокинов в реакцию вовлекаются макрофаги, играющие основную роль в формировании очага иммунного воспаления (неспецифический этап). Клинически реакция проявляется только после разрешающей инъекции антигена (гаптена), обычно через 7 сут. после сенсибилизации организма. Основные этапы реакции показаны на рис. 18.5. Через 24 час. после разрешающей инъекции антигена в подушечки правой задней лапки мышей убивают, определяют толщину или массу отрезанных правой и левой задней лапки и высчитывают соотношение изучаемых параметров. Принципиальная схема опытов показана на рис. 18.5.
Действие изучаемых факторов на реакции клеточного иммунитета определяется в результате их введения в разные сроки до-, во время или после первого и/или второго введения антигена (гаптена).
Линейные животные