Механизм V(D)J-рекомбинации

25.10.2015

Основной смысл V(D)J-рекомбинаци и зародышевой ДНК заключается в образовании зрелых полноценно функционирующих генов, кодирующих вариабельные и константные области рецепторного антигенраспознающего аппарата T- и В-лимфоцитов и продуцируемых В-клетками иммуноглобулинов, путем объединения генных сегментов, локализующихся в разных участках одной и той же хромосомы.
Как неоднократно отмечалось ранее, несмотря на различное строение зародышевых генных структур, кодирующих TCR, BCR, легкие (Igλ и Igκ) и тяжелые цепи (IgH) иммуноглобулинов, их рекомбинация происходит по сходному механизму. На начальных этапах созревания лимфоцитов и реанжировки генных сегментов происходит рандомная рекомбинация генных сегментов. Например, на уровне зародышевых генов IgH и β-локуса TCR, один из множественных генов D-сегмента рандомно рекомбинирует с одним из множественных генов сегмента J (рис. 12.9). Затем один из V-генов рекомбинирует с реанжированным участком DJ. Однако следует отметить, что этот механизм рекомбинации характерен только для IgH и β-локуса TCR.
Поскольку генные V-сегменты локуса δ TCR локализуются не только в 5’-конце, но и в 3’-конце зародышевой ДНК (рис. 12.6), указанная последовательность рекомбинации генов в данном локусе не соблюдается, рекомбинация происходит в любом направлении.

Механизм V(D)J-рекомбинации

В зародышевых ДНК, не имеющих сегмента D (α- и γ-локусы TCR, локусы легких цепей Igκ и Igλ), рекомбинация генов происходит более просто, в результате реанжировки генных сегментов V- и J-областей, которая определяет комбинаторную множественность (Combinatorial diversity) соединенных последовательностей нуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность полипептидной цепи.
Указанные процессы в В-лимфоцитах осуществляются последовательно, вначале в генах, кодирующих тяжелые (H) цепи. После этого происходит рекомбинация генов в легких (L) цепях — к (Igκ) и затем в X (Igλ). Рекомбинация генов первоначально индуцируется в одной из хромосом и при ее удачном осуществлении (подключение С-генов к продуктам V(D)J-рекомбинации и транскрипция мРНК) происходит во второй хромосоме. При неудачной рекомбинации процесс объединения генов во второй хромосоме блокируется и клетка, как правило, подвергается запрограммированной гибели (апоптозу). Поскольку иммуноглобулины (антитела) представляют собой растворимую форму антиген распознающего рецептора (BCR) В-лимфоцитов, процессы V(D)J-рекомбинации характеризуют формирование как антигенраспознающего репертуара В-клеток, так и секретируемых ими молекул иммуноглобулинов.
Принципиально сходные процессы происходят при формировании антигенраспознающего репертуара в Т-лимфоцитах. Вначале происходит перестройка генов Dβ и Jβ (проТ-клетка), затем происходит V(D)J-рекомбинация, как на уровне Vβ-, так и на уровне Vγ- и Vδ-сегментов (преТI-клетка). На стадии преТII обеспечивается формирование комплекса в результате соединения образованной β-цепи с α-цепью проторецептора (пpeTCR-α), содержащего полипептидные цепи антигена CD3. Синтез всех компонентов рецептора сопровождается его экспрессией на лимфоците. Это справедливо как для T-, так и для В-клеток. Решающую роль в формировании полноценного рецепторного комплекса играют сигналы обратной связи, образующиеся при воздействии белков RAG-1 и RAG-2 на процесс V(D)J-рекомбинации. На стадии образования рецепторного комплекса важной стадией является развитие процесса аллельного исключения, в силу которого отдельный лимфоцит экспрессирует только одну функционально реанжированную аллель тяжелой и легкой цепи гена антигенраспознающего рецептора. Это справедливо для локусов IgH, IgL (Igκ и Igγ) и для β-локуса TCR, но не для локусов a и 6 TCR. Поскольку иммуноглобулины характеризуются структурой H2L2, аллельное исключение обеспечивает возможность формирования и секреции отдельной клеткой иммуноглобулинов только одной специфичности.
Непосредственно механизм V(D)J-реком6инации проходит ряд последовательных стадий. Одной из первых является стадия образования синапса (Sinapsis), в результате которого генные сегменты хромосомы становятся восприимчивыми к рекомбинации. На последующей стадии — образования хромосомной петли происходит рандомное соединение двух кодирующих сегментов (D и J или V и J, в зависимости от строения цепи) и их ближайших рекомбинационных сигнальных последовательностей — RSS (рис. 12.8).
Инициирующую роль в этой стадии играют белки RAG-1 и RAG-2, кодируемые специфическими генами, активирующими рекомбинацию (Recombination-activating gene 1 and 2). Эти белки именуют также V(D)J-рекомбиназами. Реанжировку иммуноглобулиновых генов и генов TCR осуществляет одна и та же рекомбиназа. Рекомбиназа имеется только в T- и В-клетках, активна только в незрелых лимфоцитах. Именно поэтому реанжировка генов Ig и TCR не происходит в клетках, экспрессирующих функциональные антигенраспознающие структуры. Экспрессия генов RAC главным образом в фазы G0 и G1 клеточного цикла и их неактивность в пролиферирующих клетках сводят к минимуму риск образования несоответствующих разрывов ДНК в течение ее репликации или в течение митоза.
На стадии сегментации (Cleavage) RAG-1, подобно рестрикационной эндонуклеазе, распознает последовательности ДНК в соединении между гептамером RSS и сегментом зародышевой ДНК, кодирующим регион антигенраспознающего рецептора, и надрезает ее. Однако ферментативная активность белка RAG-1 проявляется только в присутствии белка RAG-2. Образуется тетрамер, позволяющий удерживать вместе генные сегменты в течение определенного времени и на определенной стадии развития лимфоцитов, а также связывать другие белки с «открытым» локусом рецепторных генов. Свободная группа 3’ОН, высвобождающаяся из индуцированного RAG-1 надреза ДНК, воздействует на фосфодиэфирные связи второй нити, формируя полноценный разрыв двунитевой ДНК и образуя ковалентную «шпильку» (Hairpin) на конце функционального гена.
Происходящие эффекты с участием негомологичной ДНК (RSS) обеспечивают вовлечение в развивающийся процесс ряда молекулярных структур, выполняющих разные функции и способствующих механизму соединения произошедших разрывов ДНК. К их числу относят нуклеазы Artemis, молекулы, способствующие соединению разрывов ДНК — Кu70 и Кu80, протеинкиназную каталитическую субъединицу ДНК (DNA-PKcs), молекулы XRCC4, терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), обеспечивающую формирование соединительного разнообразия (Junctional diversity) антигенраспознающих структур, лигазу IV ДНК и др.
При помощи молекул Кu70 и Ku80, XRCC4, лигазы IV ДНК происходит соединение сигнальных концов ДНК (покоящиеся RSS) в округлое кольцо, которое именуется сигнальным соединением (Signal joint) и затем утрачивается клеткой (рис. 12.10). Более комплексным является формирование так называемого кодирующего соединения (Coding joint) на основе участков ДНК, содержащих шпильки на концах функционального гена (рис. 12.10). В его образовании участвуют Ки70 и KuSOб XRCC4, лигаза IV ДНК, DNA-PKcs, Artemis. Кодирующее соединение, в отличие от сигнального, участвует в продолжающемся процессе рекомбинации генных сегментов.
Дальнейшее развитие процесса рекомбинации заключается в модификации кодирующего (но не сигнального) соединения путем добавления или удаления оснований, что обеспечивает формирование еще большего разнообразия антигенраспознающих структур. Эти процессы развиваются в стадиях кодирования (Coding) и процессинга (Processing), завершаются на стадии соединения (Joining).
Существенным следствием V(D)J-рекомбинации является максимилизация транскрипционной активности промоторов (участков связывания PHK-полимеразы, обеспечивающей синтез РНК на ДНК), локализованных непосредственно на 5’-конце перед генным сегментом V, в результате их тесного соединения с энхансерами (локусы ДНК, связывающие транскрипционные факторы, повышающие активность только определенных генов), локализованными в J-C-интронах и в области генов С-региона 3’-конца (рис. 12.6, 12.7).
Механизм V(D)J-рекомбинации

Под влиянием образующихся разрывов ДНК активируются белки Кu70 и KuSO, соединяющие ее разорванные нити. Эти белки вовлекают в процесс репарации двунитевой ДНК каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK), которая фосфорилируется и в результате этого активирует фермент Artemis. На стадии кодирования (открытии «шпильки») и процессинга в результате нуклеолитического действия фермента Artemis «шпильки» кодирующих концов ДНК разрезаются по центру или на расстоянии нескольких нуклеотидов от центра. В случае асимметричного разреза «шпильки» образуются нити ДНК различной длины (рис. 12.11). Эти различия компенсируются изменением длины нависающих концов нуклеотидов путем добавления или удаления оснований, имеющих короткий инвертированный конец, или палиндром, именуемый регионом P (Р region).
Механизм V(D)J-рекомбинации

Вне зависимости от формирования региона Р, кодирующие сегменты (VD, VJ или DJ) до соединения их концов могут быть увеличены или укорочены путем добавления или удаления рандомных нуклеотидов в результате нематричной реакции, катализируемой терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT). Такой, вновь образованный, регион именуют регионом N (рис. 12.11). На стадии соединения формирующееся разнообразие структуры в результате соединения кодирующих сегментов обеспечивает образование так наз. соединительной множественности антигенраспознающих структур иммуноглобулинов и поверхностных молекул T- и В-лимфоцитов.
Механизм V(D)J-рекомбинации

На рис. 12.12 показана принципиальная схема последовательных стадий V(D)J-рекомбинации кодирующих генных сегментов, экспрессии генов α- и β-цепей TCR и сборки их продуктов. Аналогичные стадии характеризуют V(D)J-рекомбинацию кодирующих генных сегментов, экспрессию генов тяжелых и легких (κ и λ) цепей иммуноглобулиновых молекул (рис. 12.13). Поскольку иммуноглобулины являются растворимой формой рецепторных мембранных структур В-лимфоцитов, представленные стадии рекомбинации генов являются характерными как для BCR, так и для секретируемых В-клетками иммуноглобулинов.
Механизм V(D)J-рекомбинации

Значимость молекулярных структур, обеспечивающих развитие процесса рекомбинации кодирующих генных сегментов, заключается не только в формировании должного антигенраспознающего репертуара T- и В-лимфоцитов, но и в создании условий, необходимых для нормального функционирования системы иммунитета. Так, в результате мутаций нуклеазы Artemis ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) или белков RAG-1 и RAG-2 развивается тяжелый комбинированный иммунодефицит — SCID (Severe combined immunodeficiciency), характеризующийся отсутствием T- и В-клеток. В случае частичной утраты функций в процессе развития мутаций в генах RAG, ARTEMIS и IL-7Rαразвивается редкое заболевание — синдром Оменна (Omenn syndrome) со сниженным числом лимфоцитов, иммунодефицитом и аутоиммунным компонентом.
В этом случае при V(D)J-рекомбинации формируется небольшое число лимфоцитов с антигенраспознающим рецептором, но репертуар таких клеток недостаточен для формирования хорошего защитного потенциала, а их небольшие количества оказываются дисрегуляторами аутореактивных клеток.