Естественные клетки-киллеры (NK-лимфоциты)

24.10.2015

Естественные клетки-киллеры, натуральные киллеры или NK-клетки (Natural Killer) характеризуются по сравнению с другими лимфоцитами меньшей численностью, наличием в цитоплазме азурофильной зернистости, большими размерами. Поэтому EKK именуют еще и большими гранулярными лимфоцитами. Считается, что все EKK являются большими гранулярными лимфоцитами, однако не все большие гранулярные лимфоциты являются естественными киллерами.
EKK имеют общего предшественника с Т-лимфоцитами — лимфоидную стволовую клетку костномозгового происхождения (общий лимфоидный предшественник). Считают, что EKK развиваются в селезенке из незрелых тимоцитов фенотипа CD4-, CD8-. Их локализация характеризуется рядом особенностей. EKK отсутствуют в лимфатических протоках и циркулируют только в периферической крови, преимущественно локализуются в печени, выявляются также в слизистых оболочках, особенно репродуктивных органов и в красной пульпе селезенки, составляют 5-20% от общего числа лимфоцитов.
EKK не проявляют способности к эндоцитозу, не умеют распознавать чужеродные антигены с помощью классических механизмов, поскольку не имеют антигенраспознающих рецепторов типа mlg (Membrane Immunoglobulin, мембранный иммуноглобулин) В-лимфоцитов или TCR Т-лимфоцитов. Молекулярной основой распознавания генетически чужеродных антигенов является скрининг естественным киллером экспрессии антигенов гистосовместимости класса I (MHC-I) на потенциальных клетках-мишенях. Выявление клеток, утративших или несущих МНС-I, но отличающихся от собственных, сопровождается активацией EKK и уничтожением клетки-мишени, распознанной как «не своя», т.е. чужеродная. В связи с этим считается, что миссия EKK заключается в поиске и распознавании не «чужого», а «отсутствующего своего» («missing-self» hypothesis). «He свое» подлежит немедленному уничтожению без определения степени чужеродности и наличия сигналов со стороны корецепторов, без предварительной сенсибилизации эффекторных лимфоцитов и без дополнительной их дифференцировки в киллерные клетки наподобие ЦТЛ. Обычно экспрессия антигенов гистосовместимости падает при трансформации нормальных клеток организма в раковые или в результате инфицирования клеток внутриклеточными микробами. Именно поэтому естественные киллеры наиболее активны против таких клеток. Литическая активность EKK не сопровождается формированием клеток памяти.
Процесс цитотоксического действия EKK аналогичен таковому, характерному для других цитотоксических клеток, например сенсибилизированных Т-киллеров, и протекает без участия антител и комплемента. Подобно цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ), в месте контакта с клеткой-мишенью EKK образуют иммунологический синапс в качестве первой дискретной стадии взаимодействия этих клеток. Иммунологический синапс с помощью молекул адгезии удерживает взаимодействующие клетки в зоне контакта в течение времени, необходимого для распознавания генетически чужеродного материала и осуществления первичных иммунологических реакций. Как и при взаимодействии других клеток системы иммунитета, иммунологический синапс, образуемый ЕКК, состоит из двух компонентов — pSMAC (peripheral supramolecular activation complex — периферический супрамолекулярный активационный комплекс) и cSMAC (central supramolecular activation complex — центральный супрамолекулярный активационный комплекс). В зоне периферического комплекса EKK накапливаются молекулы CD2, LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen-1 — антиген, ассоциированный с функцией лимфоцитов), Мае-1, f-актина, тогда как в центральной части синапса накапливаются гранулы перфорина. В зоны, окружающие молекулы LFA-1, вовлекаются молекулы KIR и SHP-1. Имеются также сведения о наличии в зонах синапса EKK молекул NKG2D/DАP10 и Vav1. Локализация других молекул в зонах pSMAC и cSMAC осуществляется в зависимости от результатов распознавания клетки-мишени — приведет ли клеточный контакт к лизису клетки-мишени?
При распознавании взаимодействующей клетки-мишени как генетически чужеродной EKK секретируют содержимое преформированных цитоплазматических гранул (порообразующий гликопротеин перфорин, сериновые протеазы — гранзимы), нарушающее целостность ее мембраны. Клетка-мишень погибает в результате осмотического дисбаланса с внеклеточной жидкостью и развивающегося апоптоза, a EKK освобождаются от мишени, вступают в фазу покоя и могут вновь активироваться для осуществления нового цикла лизиса клеток мишеней. Изучение роли перфорина в мышиных модельных системах установило, что при его врожденном дефиците EKK не функционируют, животные проявляют повышенную чувствительность к внутриклеточным паразитам и к инфекциям.
Вступление EKK в стадию покоя или активации определяется активностью экспрессируемых ими на мембране рецепторов ингибирующего или активирующего типа соответственно. Принципиальное различие этих двух типов трансмембранных рецепторов EKK заключается в строении их цитоплазматического конца. У рецепторов активирующего типа (рис. 5.1) цитоплазматический участок несет домен ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif — тирозинсодержащие активационные последовательности аминокислот в иммунорецепторах) с аминокислотной последовательностью YxxL/I-xxxxxxx-YxxL/I, где Y — тирозин, L — лейцин, I — изолейцин, х — какой-либо аминокислотный остаток.

Естественные клетки-киллеры (NK-лимфоциты)

Отдельные активирующие рецепторы EKK имеют короткий цитоплазматический конец и не содержат доменов НАМ. В этом случае их положительно заряженный сегмент взаимодействует с отрицательно заряженным в трансмембранной области адаптерным белком (DAP10, DAP12 или FceRIγ), содержащим цитоплазматический домен ITAM (DAP12, FcERIγ) или иной активационный сигналпроводящий домен с другой аминокислотной последовательностью, в частности YxxM, где Y — тирозин, х — какой-либо аминокислотный остаток, M — метионин (DAP10). В любом случае формирование внутриклеточного сигнального пути и дальнейшее прохождение сигнала в клетке индуцируется сигналпроводящими доменами, ассоциированными с заякоренными в цитоплазме цепями рецепторной структуры.
Естественные клетки-киллеры (NK-лимфоциты)

У рецепторов ингибирующего типа (рис. 5.2), наоборот, цитоплазматический участок несет домен ITlM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif — тирозинсодержащие ингибирующие последовательности аминокислот в иммунорецепторах) с иной аминокислотной последовательностью: I/V/L/SxYxxL/V, где I — изолейцин, V — валин, L — лейцин, S — серин, х — какой-либо аминокислотный остаток, У отдельных рецепторов ингибирующего типа домен ITIM комплексируется с доменом ITSM (от Immunoreceptor Tyrosine-based Suppresssory Motif), также обладающим сигнал проводящими свойствами.
Лигандами для рецепторов обоего типа служат антигены главного комплекса гистосовместимости. Важной особенностью этих рецепторов является то, что специфичность активирующих рецепторов идентична таковой ингибирующих рецепторов, однако аффинность ингибирующих рецепторов по отношению к лигандам, взаимодействующим с рецепторным аппаратом ЕКК, существенно выше по сравнению с аффинностью активирующих рецепторов. Поэтому в отсутствие возмущающих воздействий под влиянием ингибирующих рецепторов, испытывающих постоянный прессинг со стороны собственных МНС-I, EKK находятся в покоящемся состоянии. При превышении порога сигнала, активирующего ингибиторные рецепторы, включаются рецепторы активирующего типа. Их активация сопровождается формированием сигнального пути каскадного типа, приводящего к активации функций ЕКК. При снижении уровня сигнала, необходимого для включения активирующих рецепторов, процесс клеточной активации затухает, вновь обеспечивая необходимые условия для функционирования ингибиторных рецепторов.
Необходимо отметить, что наличие активирующих и ингибирующих рецепторов одинаковой специфичности характерно не только для ЕКК. Такие рецепторные структуры имеются на поверхности T- и В-лимфоцитов.
Среди многих мембранных структур EKK уникальными функциями (активирующими или ингибирующими с сигналформирующей активностью) характеризуются рецепторы четырех семейств — NCR (Natural cytotoxicity Receptors), KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors), ILT (Immunoglobulin-Like Transcript), CD94/NKG2. Другие рецепторы, способные активировать EKK (CD2, CD16, CD26, CD69, (β1-интегрины), не являются для них уникальными, экспрессируются на многих других типах клеток. Для трех из указанных уникальных для EKK семейств (KIR, ILT, CD94/NKG2) лигандами являются антигены MHC-I (см. рис. 5.1 и 5.2), для NCR лиганды не установлены.
Рецепторы семейства NCR являются активирующими, включают молекулы NKp30, NKp44 и NKp46, относятся к суперсемейству иммунолобулинов, литическая активность EKK непосредственно связана с их экспрессией на клеточной мембране.
Корецептор NTB-A может запустить цитолитическую реакцию EKK в присутствии NCR большой плотности.
Рецептор активирующего типа 2В4 (CD244) с высокой степенью аффинности связывается с лигандом CD48, может участвовать в цитолитической функции EKK в качестве корецептора с активирующим рецептором NKp46, относится к подсемейству CD2 суперсемейства иммуноглобулинов, имеет 4 цитоплазматических домена, трансмембранный сегмент и 2 внеклеточных иммуноглобулиноподобных домена, экспрессируется на всех EKK и γδТ-лимфоцитах, на части CD8- (50%) и CD4- (0,5-5%) Т-клеток, на моноцитах, базофилах и др.
NКр30 и NKp46 ассоциированы с рецептором FcεRIγ и белком ζ, рецептор NKp44 — с белком DAP12. Рецепторы семейства NCR играют доминирующую роль в разрушении опухолей, вырабатывают цитокины, усиливающие миграцию клеток в места локализации опухолевого роста и инфицирования. Лиганды NCR не установлены.
Из 14 известных рецепторов семейства KIR шесть являются активирующими, остальные 8 — ингибирующими.
Активирующие рецепторы — KIR2DS1 (CD158h), KIR3DS1 (CD158e2), KIR2DS2 (CD158)), KIR2DS4 (CD158i), KIR2DS5 (CD158g), KIR2DS6 (CD158c) (см. рис. 5.1).
Ингибирующие рецепторы — KIR2DL1 (CD158a), KIR3DL1 (CD158e1), KIR2DL2 (CD158bl), K1R3DL2 (CD158k), K1R2DL3 (CD158b2), KIR2DL4 (CD158d), KIR2DL5 (CD158f), KIR3DL7 (CD158z) (см. рис. 5.2).
Все рецепторы семейства KIR относятся к суперсемейству иммуноглобулинов, в строении рецепторов этого семейства приняты следующие обозначения: KIR (например в рецепторе KIR2DS1) означает Killer Immunoglobulin-like Receptor; последующая цифра и следующий за ней символ D показывают количество иммуноглобулиноподобных внеклеточных доменов в этих рецепторах: в рецепторе KIR2DS1 их два, в рецепторе KIR3DL7 — три. Следующие символы S (Short) или L (Long) означают короткий (например в рецепторе KIR2DS1) или длинный (например в рецепторе KIR3DL7) цитоплазматический хвост. Последняя цифра в конце — кодовый номер рецептора.
Как видно из рис, 5.1 и 5.2, KIR-рецепторы с коротким (S) цитоплазматическим сегментом являются стимулирующими, тогда как рецепторы с длинным (L) цитоплазматическим участком — ингибирующими. Характер действия рецептора, как уже отмечалось, определяется доменами цитоплазматического рецепторного сегмента — ITAM или ITIM, фосфорилирование которых индуцируется взаимодействием рецептор-лиганд и сопровождается образованием активирующего или ингибирующего сигнала и формированием внутриклеточного активирующего или ингибирующего, соответственно, сигнального пути. Внутриклеточные L-сегменты рецептора KlR имеют домены ITIM, активация которых приводит к образованию ингибирующего сигнального пути. В результате взаимодействие KIR-рецепторов EKK с доменами ITIM и клеток-мишеней, экспрессирующих тождественные с EKK антигены МНС-I, приводит к образованию ингибиторного сигнала и EKK клетки-мишени не лизируют. KIR-рецепторы с внутриклеточными положительно заряженными S-сегментами сигналформирующих доменов не имеют, но взаимодействуют с отрицательно заряженными в трансмембранной области адаптерным сигнальным белком DAP12, имеющим цитоплазматический домен ITAM. В результате активации этих структур взаимодействием лиганд-рецептор образуется активирующий сигнал и формируется внутриклеточный активационный путь, приводящий к активации цитолитической активности EKK против клеток-мишеней.

Рецепторы EKK семейства KlR характеризуются еще одной особенностью. Среди рецепторов с ингибиторной активностью имеются два — KIR2DL4 и KIR2DL5, существенно отличающиеся от других ингибиторных рецепторов KIR, как по структуре внеклеточных и цитоплазматических доменов, так и по функциональной активности, В отличие от внеклеточных иммуноглобулиноподобных доменов большинства ингибиторных рецепторов ЕКК, имеющих конфигурацию D1-D2 (KIR2D) или DO-D1-D2 (KIR3D), домены рецепторов KIR2DL4 и KIR2DL5 имеют конфигурацию D0-D2 (см. рис. 5.2). Кроме того, цитоплазматическая область большинства ингибиторных рецепторов содержит по 2 домена ITIM, тогда как рецепторы K1R2DL4 и KIR2D5 содержат по одному такому домену. Более того, в дополнение к домену ITIM рецептор KIR2DL5 содержит домен ITSM (Immunoreceptor Tyrosine-based Switch Motif) с аминокислотной последовательностью TxYxxV/I, где T — треонин, Y — тирзин, V — валин, I — изолейцин, х — какой-либо аминокислотный остаток. Эти рецепторы отличаются от других рецепторных структур и по функциям. Так, несмотря на наличие домена ITIM, рецептор KIR2DL4 обеспечивает проявление как ингибиторных, так и активационных функций ЕКК. Активация рецептора в покоящихся EKK сопровождается индукцией секреции ИНФγ, тогда как активация рецептора в ранее активированных EKK приводит к развитию их цитотоксической активности. Как уже отмечалось, лигандами для рецепторов семейства KIR служат антигены HLA-I.
В семействе рецепторов ILT (CD85), синонимы LIR — Leucocyte Immunoglobulin-like Receptor или MIR — Macrophage Immunoglobulin-like Receptor, три рецептора определены как активирующие: ILT1 (LIR7), ILT7 и ILT8, остальные (не менее 8) — как ингибиторные. Активирующие рецепторы семейства ILT в их цитоплазматической части домена ITAM не имеют, но образуют комплекс с сигнал проводящим ITAM-содержащим адаптерным белком FcεRIγ (рис. 5.1), Рецептор ILT2 с ингибирующей активностью, в отличие от других рецепторов этого типа, содержит четыре внеклеточных иммуноглобулиноподобных домена конфигурации D1-D2-D3-D4 и четыре цитоплазматических домена ITIM (рис. 5.2). Ho четыре внеклеточных иммуноглобулинподобных домена экспрессируют и рецепторы ILT активирующего типа. Лигандами для рецепторов семейства ILT служат антигены HLA-I.
В семействе CD94/NKG2 обнаружено три рецептора активирующего типа (CD94/NKG2C, CD94/NKG2E и CD94/NKG2H) и два — ингибиторного (CD94/ NKG2A и CD94/NKG2B). Рецепторы этого семейства характеризуются как гетеродимеры, образованные молекулой CD94 и рецептором NKG2. Антиген CD94 сигнальной функцией не обладает, но, взаимодействуя с антигенами МНС-I, обеспечивает проведение сигнала через связанные с ним ковалентной связью молекулы NKG2. Активирующие сигналпроводящие молекулы NKG2 домена ITAM не содержат, но связываются в трансмембранной области с отрицательно заряженным адаптерным ITAM-содержащим адаптерным белком DAP12, через который и передается активирующий сигнал внутрь клетки. Лигандами для большинства форм рецептора CD94/NKG2 являются HLA-E — неклассические молекулы HLA класса I.
К молекулярным структурам EKK активирующего типа относится также рецептор NKG2D, Этот рецептор экспрессируется на мембране EKK в виде гомодимера (рис. 5.1), домена ITAM не содержат, но связываются в трансмебранной области с отрицательно заряженным адаптерным белком DAP10, имеющим ITAM-подобный домен с аминокислотной последовательностью YxxM, где Y — тирозин, M — метионин, х — какой-либо аминокислотный остаток. Через этот домен активирующий сигнал передается внутрь клетки. Помимо EKK рецептор NKG2D экспрессируется на αβ- и γδТ-лимфоцитах, является костимулирующей молекулой Т-лимфоцитов фенотипа GD8. Лигандами рецептора NKG2D являются антигены MICA и MICB, структурно родственные антигенам HLA класса I, а также антигены ULBP, экспрессирующиеся на инфицированных вирусом и на опухолевых клетках.
Рецепторы EKK ингибирующего типа GD94/NKG2A и CD94/NKG2B в цитоплазматическом сегменте имеют по два сигналпроводящих домена ингибирующего типа ITIM (рис. 5.2), лигандами для рецепторов являются антигены HLA-I — HLA-E. Особенностью лиганда HLA-E — неклассического MHC-I — является то, что эта молекула включает пептиды HLA-A, HLA-В, НLA-C или HLA-G.
EKK продуцируют широкий спектр цитокинов, включающий факторы хемотаксиса, ИЛ-1, -2, -5, -8, -12,-15, ИНФα, β и γ, ФНОα и β, ГМ-КСФ, серотонин, адреналин, простагландины, β-эндорфин и др. Эти факторы играют важную роль в развитии воспаления и в регуляции клеточных функций, обеспечивающих элиминацию патогена из организма. Так, будучи активированными, NK стимулируют гемопоэз (ГМ-КСФ), дифференцировку и мобилизацию эозинофилов (ИЛ-5), усиливают воспалительную реакцию в очаге (ИЛ-8), вносят вклад в изменение терминальной дифференцировки иммунных Т-лимфоцитов фенотипа CD4, обеспечивая иммунное отклонение в пользу Тhi (ИНФγ). EKK являются основным продуцентом ИНФу, активирующим фрагментацию фагоцитированного макрофагом антигена.
EKK человека характеризуются фенотипом CD3-, CD16+, CD56+ (NCAM-I), мышей — NKLl+ (или DX5- или асиало-GM1+), FcγRII/III+, CD3+. CD16 — это низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (FcγRIIIA), ассоциированный с рецептором FcεRIγ и белком ζ.
Помимо указанных антигенов EKK экспрессируют антигены, характерные для Т-лимфоцитов (CD2, CD7, CDB, CD57, CD122), моноцитов-макрофагов (CD11/CD18), селектины, β-интегрины, антигены VLA-4, VLA-5, VLA-6 и др.
Существенная роль в активации EKK принадлежит дендритным клеткам, стимулирующим продукцию ИНФа, размножение и цитотоксическую активность NK-клеток.