Культивирование стволовых клеток

24.10.2015

В 1961 году J.E. Till и Е.А. McCulloch показали, что гемопоэтические ткани мышей содержат в своем составе стволовые клетки, которые идентифицируются по способности давать очаги роста в селезенке летально облученных реципиентов, т.е. животных, которым пересаживают полученные от доноров клетки, ткани или органы. Такие клетки, названные KOEc — селезеночными колониеобразующими единицами (от CFUs — Colony-forming units of spleen), выявлены в костном мозгу, селезенке и в периферической крови интактных животных. Через 8-10 дней после переноса облученным мышам они формируют в результате пролиферации и дифференцировки макроскопически видимые колонии эритроидного (42-55% от общего числа колоний), гранулоцитарного (14-24%), мегакариоцитарного (18-21%) и смешанного (16-21%) типов, каждая из которых состоит примерно из 10в6 клеток. Среди колоний смешанного типа выявляют эритроидные + гранулоцитарные, эритроидные + мегакариоцитарные, гранулоцитарные + мегакариоцитарные, эритроидные + гранулоцитарные + мегакариоцитарные.
Число формируемых колоний находится в линейной зависимости от количества трансплантированных клеток. Это дало возможность рассчитать, что при переносе реципиентам 1 млн ядросодержащих клеток костного мозга в селезенке реципиентов образуется 100 колоний. В донорской селезенке содержится в 10 раз меньше KOEс. В периферической крови на 10в6 лейкоцитов приходится 1-6 KOEс.
Колонии кроветворных клеток образуются в селезенке не только летально облученных реципиентов, но и сублетально облученных мышей. В последнем случае трансплантация гемопоэтических клеток не требуется, колонии формируются в результате пролиферации и дифференцировки неповрежденных облучением эндогенных стволовых клеток. Облучение животных в экспозиционных дозах, меньших чем 129 мКл/кг (500 Р), обеспечивает образование несосчитываемого числа эндогенных колоний вследствие их сливного роста. С увеличением дозы облучения число эндогенных колоний падает и находится в прямой зависимости от дозы радиационного воздействия.
Как эндогенные, так и экзогенно введенные KOEс высокочувствительны к действию радиации. D0 для первых составляет 20,1 мКл/кг (78 Р), для вторых — 0,95 Гр (95 рад).
При анализе характера дифференцировки стволовых кроветворных клеток in vivo в качестве оцениваемого критерия обычно используют отношение числа колоний эритроидного типа к гранулоцитарным (Э/Г), определяемым в селезенке или в костном мозгу летально или сублетально облученных мышей. В норме в селезенке формируются колонии преимущественно эритроидного типа (отношение Э/Г -2:1), в костном мозгу — гранулоцитарного (Э/Г 0,5-0,7).
Открытие возможности количественно точного подсчета численности колоний кроветворных клеток, формируемых гемопоэтическими клетками-предшественниками, и характера их дифференцировки in vivo представляется важнейшим достижением клеточной биологии. Была создана экспериментальная основа для изучения количественных закономерностей функциональной активности стволовых клеток, исследования механизмов их размножения и созревания в клеточные формы различных ростков кроветворения, анализа факторов эндогенной и экзогенной природы, оказывающих регуляторное влияние на эти процессы. Был сформулирован ряд крупных обобщений, оказавших огромное влияние не только на дальнейшее развитие иммунологии, но и на ряд смежных дисциплин — гематологии, физиологии, цитологии, генетики, биохимии и др. К числу фундаментальных обобщений общебиологической значимости следует огнести следующие.
— Установлена клональная природа колоний, формируемых КОЕ. Все делящиеся клетки отдельной колонии несут один и тот же хромосомный маркер. Иначе говоря, каждая колония представляет собой клон клеток, происходящих от одной кроветворной клетки-предшественника.
— Показана высокая пролиферативная активность колониеобразующих клеток.
— Доказано, что колониеобразующие клетки способны к самоподдержанию. Перенос клеток какой-либо одной колонии новым летально облученным реципиентам приводит к образованию колоний всех трех гистологических типов (эритроидных, гранулоцитарных, мегакариоцитарных),
— Установлена полипотентность колониеобразующих клеток. Костномозговые клетки, формирующие колонии в селезенке летально облученных реципиентов, репопулируют кроветворные и лимфоидные ткани облученных мышей, проявляют защитные свойства и обеспечивают клеточную основу для развития реакций гуморального и клеточного иммунитета.
— Доказана способность стволовых кроветворных клеток к миграции и циркуляции.
Таким образом, культивирование in vivo колониеобразующих клеток определило их основные свойства, позволившие считать эти клетки стволовыми. Они способны к самоподдержанию, быстро размножаются, мигрируют, циркулируют, полипотентны, дифференцируются в зрелые формы клеток разных ростков кроветворения.
Среди изученных свойств стволовых кроветворных клеток специального внимания заслуживает их способность к миграции и размножению. Миграционная активность дает возможность стволовым клеткам передвигаться по организму, обеспечивая в случае необходимости и наличия соответствующих условий быстрое восполнение соответствующего клеточного дефицита. Именно вследствие способности стволовых кроветворных клеток к миграции и циркуляции их выселение из экранированного костного мозга обеспечивает защиту животных при летальном облучении особей. Благодаря способности к размножению формируется масса клеток, необходимая и достаточная для накопления клеток соответствующего ростка.