Стволовые клетки, их количественное определение и факторы, контролирующие функции клеток-предшественников

24.10.2015

Пониманию проблемы структурно-функционального строения системы иммунитета и генетической обусловленности осуществляемых этой системой иммунологических реакций в значительной степени способствовали исследования функций стволовых кроветворных клеток (CKK) и организменных систем их регуляции.
Первые сведения о стволовых клетках относятся к началу XX века, когда выдающийся русский гистолог, профессор Санкт-Петербургской Военно-медициской академии Александр Александрович Максимов постулировал наличие единой родоначальной клетки для клеток крови, отождествляя ее с лимфоидными элементами. В течение многих лет этот постулат носил чисто теоретический характер и только в начале 60-х годов XX века канадские исследователи Till J.E. и McCulloch Е.А. получили экспериментальное подтверждение этого предположения. Авторами было установлено, что трансплантация мышиных клеток костного мозга летально облученным сингенным реципиентам сопровождается образованием в их селезенках дискретных, видимых на глаз колоний кроветворных клеток. Было доказано, что клетки каждой колонии являются потомками одной стволовой кроветворной клетки, В случае сублетального облучения мышей колонии гемопоэтических клеток в селезенке формируются CKK эндогенного происхождения. Определяемые клетки-предшественники были названы «единицами, образующими колонии в селезенке (КОЕс)», В 1982 году М.С. Magli et al. показал, что колонии гемопоэтических клеток в селезенке облученных реципиентов формируют, по меньшей мере, два типа предшественников. «Ранние» колонии (7-8-суточные) образуют преимущественно коммитированные предшественники эритроидных клеток, «поздние» (10-12-суточные) — менее зрелые стволовые элементы, способные дифференцироваться в направлении различных ростков кроветворения. Разработка методологии, позволяющей количественно определять численность CKK, явилась мощным фактором, индуцирующим экспериментальное изучение функций стволовых клеток и регулирующих их факторов.
Миграционную активность клеток-предшественников костного мозга разных видов животных изучал Г.С. Стрелин по защитной эффективности клеточных элементов, выселяющихся из экранированного при облучении участка костного мозга. Была показана меньшая подвижность CKK у крыс и обезьян по сравнению с мышами. Аутотрансплантация костного мозга из экранированного участка компенсировала его недостаточную защитную эффективность.
В 1972 году были опубликованы исследования P.M. Хаитова по изучению количественных закономерностей функционирования СКК. Для этих целей автор применил уникальную методологию. Оценивалась выживаемость животных при их летальном облучении и интенсивность выселения стволовых клеток при экранировании различных объемов костного мозга. На последующих этапах экранированный участок костного мозга подвергался летальному облучению при экранировании остального тела животных. Это позволило не только установить прямую зависимость между количеством экранированных клеток, числом эмигрирующих в кровоток стволовых элементов и выживаемостью облученных животных, но и количественно определить параметры темпа выселения стволовых клеток из костного мозга в зависимости от периода времени, проходящего между экранированием участка костного мозга и его последующим облучением. Осуществлялось также парабиотическое соединение сингенных мышей (целиарный анастомоз), различающихся по хромосомным маркерам (СВА/Н-Т6Т6). До операции один из партнеров парабиотического соединения, не имеющий хромосомных маркеров (СВА/Н), тотально облучался в летальных дозах, а второму, с хромосомным маркером (СВА/Н-Т6Т6), при этом экранировали задние конечности, В разное время после операции (12-60 сут.) в различных тканях (костный мозг, тимус, селезенка, лимфатические узлы) парабионта, не имеющего маркера Т6Т6, определяли с помощью хромосомного анализа численность клеток с хромосомным маркером, а в селезенке таких животных подсчитывали численность CKK методом Till J.E. и McCulloch Е.А. С помощью хромосомного анализа было доказано, что все колонии гемопоэтических клеток, сформировавшиеся через 12-14 сут. в селезенке тотально облученного парабионта, образуются стволовыми клетками, мигрировавшими из экранированного участка костного мозга второго парабионта. Было установлено также, что гемо- и лимфопоэз в разных тканях тотально облученного парабионта формируется за счет пролиферации и дифференцировки мигрирующих из костного мозга и циркулирующих в крови стволовых элементов второго парабионта. Были определены количественные параметры эмиграции CKK из костного мозга.
В 1975 году P.M. Хаитов, Р.В. Петров, Б.Б. Мороз и соавт. доказали, что на уровне организма процессы миграции и рециркуляции CKK контролируются гипофиз-адреналовой системой (уровень глюкокортикоидов в крови).
В конце 60-х годов XX века последовательное изучение регуляции функций CKK системой иммунитета начал Р.В. Петров с сотрудниками. В 1967 году Р.В. Петров и Л.C. Сеславина, изучая различные аспекты колопиеобразующей способности стволовых клеток, открыли факт их взаимодействия с лимфоцитами, определяющего функциональную активность стволовых элементов. Оказалось, что, взаимодействуя с генетически чужеродными стволовыми клетками, лимфоциты инактивируют их способность к пролиферации и дифференцировке в зрелые формы. Анализируя действие лимфоцитов на КСК, в 1968 году Р.В. Петров высказал предположение, подтвержденное как собственными исследованиями, так и впоследствии другими исследователями, что регуляторное действие лимфоцитов на CKK может распространяться и на другие клетки-предшественники, обладающие признаками стволовых элементов в смысле их способности размножаться и дифференцироваться в зрелые формы. В 1969 году Р.В. Петров опубликовал результаты исследования эффекта взаимодействия стволовых клеток с сингенными лимфоцитами. Было показано, что лимфоциты, инактивируют процессы пролиферации и дифференцировки генетически чужеродных стволовых клеток и изменяют характер дифференцировки генетически идентичных стволовых клеток. Факт взаимодействия лимфоцитов со стволовыми клетками, обнаруженный Р.В. Петровым и Л.С. Сеславиной, был зарегистрирован в качестве открытия Государственным Комитетом по делам изобретений и открытий в Государственном реестре открытий в начале декабря 1977 года. В 1970 году J.W. Goodman и Grubbs C.G. впервые описали эффект отмены явления аллогенной ингибиции CKK с помощью сингенных клеток тимуса.
Открытие эффекта взаимодействия лимфоцитов со стволовыми клетками индуцировало интенсивные исследования по изучению субпопуляций системы иммунитета, контролирующих функции СКК. В 1975 году В.М. Манько и Т.Б. Руднева описали ведущую роль Т-клеток в процессах взаимодействия CKK с генетически чужеродными лимфоцитами. В 1976 году Р.В. Петров с соавт. открыл регуляторную роль тимуса и тимических клеток в процессах миграции и дифференцировки сингенных СКК. В 1978 году проф. А.М. Поверенный и соавт. впервые обнаружили влияние клеток тимуса на пролиферативную активность сингенных СКК. Гистологические исследования В.Н. Швец и соавт. впервые подтвердили постулат RB. Петрова и установили, что регуляторное действие лимфоцитов распространяется не только на функции СКК, но и на функционирование других клеток-предшественников, например остеобластов в костномозговой полости облученных реципиентов, получивших трансплантат сингенных клеток костного мозга. Суммация этих и многих других фактов, вскрытых в процессе изучения эффекта взаимодействия CKK с лимфоцитами, свидетельствовала о том, что функции KCK находятся под совместным тимическим и Т-лимфоцитарным контролем. При этом функции KCK контролирует особая популяция Т-лимфоцитов, названная «Т-дифференцирующими лимфоцитами» — Td (Р.В. Петров, В.М. Манько). Такие клетки S.J. Sharkis et al. назвали «Antitheta-sensitive regulatory cells» (TSRC) — «регуляторные клетки, чувствительные к анти-θ-сыворотке». В этом же году В.М. Манько и соавт. впервые описали новую функцию В-лимфоцитов, не только регулирующих функции СКК, но и Т-лимфоцитов, взаимодействующих с CKK и контролирующих их функциональную активность. В 1981 году в коллективе авторов, возглавляемом проф. А.М. Поверенным, было постулировано, что популяция Т-клеток, регулирующая функции КСК, относится к популяции ПТЛ — предшественников Т-лимфоцитов. Исследованиями академика РАМН В.А. Козлова и коллектива, руководимого член-корр. РАМН И.С. Фрейдлин, было показано регуляторное влияние на функции CKK клеток системы мононуклеарных фагоцитов, в частности макрофагов.
Большой цикл исследований был выполнен in vitro по изучению факторов, регулирующих функциональную активность стволовых клеток. Такие исследования стали возможными благодаря разработанным методам культивирования кроветворных клеток в полутвердом агаре и в суспензионных культурах над слоем фрагментов костного мозга, прикрепившихся к культуральному сосуду. Для подсчета численности кластеров и колоний, формируемых предшественниками лимфоцитов in vitro, был разработан метод культивирования клеток в агаровой среде. В 1966 году И.Л. Чертков и А.Я. Фриденштейн (Москва) предположили, а затем и определили регуляторное влияние на функции KCK гемопоэтического индуктивного микроокружения, представленного стромой кроветворных органов. Было установлено, что стромальными клетками-предшественниками являются механоциты или «единицы, образующие колонии фибробластов в культуре (КОЕф)». В отличие от KOEc, определяемых в селезенке летально облученных мышей, колониеобразующие единицы, определяемые в культуре in vitro, были названы КОЕк.