Контаминация микоплазмами культур клеток

25.06.2015

В последние годы появилось большое количество публикаций о загрязнении микоплазмами первичных и перевиваемых тканевых культур и штаммов вируса. Очень часто контаминация носит скрытый характер, загрязненные культуры обычно не отстают в росте от стерильных. Причина наблюдаемой загрязненности культур тканей полностью не выяснена. Возможно, носителями микоплазм служат сыворотка крови или триптически получаемые клетки тканей различных видов животных, а также добавка к клеточным культурам антибиотиков, которые могут вызывать образование стабильных L-форм. Кроме того, ряд авторов считают, что заражение клеток происходит от человека, в ротовой полости которого обитают М. hominis тип I и М. orale.
Первое сообщение о загрязненности клеточных культур микоплазмами сделали L. Hayflick, W. Stinebring в 1955 г. Они установили, что наиболее загрязнены бывают перевиваемые линии клеточных культур. М. Barile и др. исследовали 49 перевиваемых культур тканей и в 48 случаях выделили микоплазмы, в то время как при исследовании 10 первичных культур этих микроорганизмов они не выделили. D. Herderschee из 55 перевиваемых линий в 33 обнаружил микоплазмы, а из 26 первичных культур ни в одном случае микоплазм не выделил.
Исследованиями различных авторов установлено, что микоплазмы не имеют определенной специфичности по отношению к каким-либо органам и тканям, и они могут быть изолированы из всеx органов, используемых для приготовления клеточных культур.
В таблице 17 приведена частота выделения микоплазм из различных тканей животных.

Контаминация микоплазмами культур клеток

Г.Я. Каган, И.В. Раковекая, В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган считают, что микоплазма-инфекция может иметь разное проявление в культуре ткани. Во-первых, она может протекать по типу латентной инфекции и, несмотря на активное размножение микоплазм, не выявляться при макроскопическом и микроскопическом исследованиях. Обычно зараженные клетки не отстают в росте от стерильных, и метаболизм и внешний вид их не изменяются. Во-вторых, скрытая микоплазма-инфекция, не вызывая выраженных цитопатических изменений в клетках, может тормозить их прикрепление к стеклу, обусловить замедленный рост и понизить конечный выход клеток. В-третьих, микоплазма-инфекция может иметь активный характер, вызывая цитопатический эффект в клеточной культуре. В-четвертых, микоплазма-инфекция клеточных культур, несмотря на скрытый характер, может давать пролиферирующий и трансформирующий эффект.
G. Kenny, М. Pollock, исходя из своих исследований, считают, что действие микоплазм на культуры клеток возможно или за счет продукции токсического вещества, или вследствие того, что микоплазмы паразитируют в клетках и разрушают их, или в результате того, что микоплазмы и культуры клеток конкурируют из-за продуктов питания.
Р.М. Kraemer и др. выделили из суспензий вирусов полиомы и коксаки микоплазмы, обладающие литическим действием на мышиные лимфоматозные клетки. Лизис клеток проявлялся вначале легкой агглютинацией клеток с прекращением метаболизма, а в последующем клетки разрушались.
М. Butler, R. Leach описали появление зернистости цитоплазмы клеток с Дальнейшим появлением веретеновидных и фибробластоподобных клеток в культуре Нер-2. Иногда клетки отслаивались от стекла. Полная дегенерация происходила через 7—10 дней и сопровождалась сильным закислением среды.
В связи с тем, что перевиваемые линии большинства культур тканей загрязнены микоплазмами, возникает вопрос об их деконтаминации. С этой целью применяют различные методы. Наиболее часто в среду культивирования культур тканей добавляют различные антибиотики.
D. Perlman, S. Brindle дают сводную таблицу о применении антибиотиков в культурах клеток и тканей (табл. 18).
Г.Я. Каган и И.В. Раковская рекомендуют для подбора антибиотика с целью деконтаминации культур тканей придерживаться следующего порядка: выбору антибиотика должно предшествовать определение чувствительности к нему микоплазм в агаре; антибиотик не должен воздействовать на цитоплазматическую мембрану и синтез внутриклеточных протеинов и подавлять микоплазмы в агаре в очень низких концентрациях; антибиотик должен действовать в бактерицидных дозах, чтобы предотвратить образование у микоплазм формирование устойчивости к данному препарату; после контакта клеточной культуры с определенными концентрациями антибиотиков необходимо пропассировать культуру на среде, не содержащей данный антибиотик, и лишь после этого сделать высев культуральной среды на агар. Последнее необходимо для полного освобождения от антибиотика исследуемого материала, так как присутствие в нем следов антибиотика может тормозить рост микоплазм на агаре и для получения достоверных данных об эффективности и стабильности действия использованных препаратов.
Контаминация микоплазмами культур клеток

Многие антибиотики оказывают токсическое воздействие на культуры клеток, поэтому были предложены некоторые другие методы деконтаминации клеточных культур от микоплазм. L. Hayflick рекомендует проводить деконтаминацию культур клеток действием повышенной температуры: некоторые штаммы микоплазм погибают при температуре 45° в течение 15—30 минут. Преимущество этого метода состоит в том, что клетки не подвергаются действию каких-либо препаратов. Однако некоторым исследователям не удалось достигнуть очистки культур клеток действием повышенной температуры.
М. Е. Barile и др. предложил деконтаминировать клеточные культуры путем добавления к ним специфической иммунной сыворотки. По данным авторов, добавление к культуре клеток 10% специфической иммунной сыворотки ведет к подавлению роста, микоплазм. По данным же Г.Я. Каган и И.В. Раковской, использование ингибирующего эффекта специфических сывороток для деконтаминации культур клеток может быть эффективным лишь в том случае, если микоплазмы локализуются на поверхности клеток, в случаях внутриклеточной локализации микоплазм положительного результата может не быть.