Серологическая характеристика микоплазм

24.06.2015

Виды микоплазм трудно отличить друг от друга, хотя и существуют некоторые различия в быстроте роста, морфологии колоний и клеточных элементов. По патогенным свойствам также не всегда удается отдифференцировать их, так как этот признак крайне непостоянен и воспроизвести заболевание не всегда представляется возможным. Даже заведомо патогенные культуры микоплазм (М. mycoides v. myсoides) при длительном культивировании на бесклеточных питательных средах утрачивают свою вирулентность (собственные наблюдения).
По данным ряда авторов, сапрофитные виды микоплазм менее требовательны к составу питательных сред, чем патогенные, выделенные из гениталий человека.
Несмотря па то что было предложено большое количество несерологических методов идентификации микоплазм, серологические методы остаются основными методами типизации микоплазм.
Наибольшее признание среди серологических методов получили реакции агглютинации, связывания комплемента и ингибиции роста. В последние годы многие авторы рекомендуют также использовать реакции гемагглютинации, задержки гемагглютинации, торможения наведенной (косвенной) гемагглютинации, ингибиции метаболизма, а также реакцию агглютинации, которую ставят с латексом.
В.Д. Тимаков и Г.Я. Каган указывают, что при проведении разносторонних иммунологических исследований, в частности при разработке вопросов, касающихся серологической и антигенной характеристики микоплазм, необходимо использовать несколько серологических методов, данные которых должны дополнять друг друга.
Нa основании показаний реакции агглютинации и ингибиции роста Н. Gerlach установил 20 серологических типов микоплазм, выделенных от птиц, причем вирулентными были серотипы А (М. gallisepticum), H (М. meleagridis) и F (М. synovae). Т. Barber, J. Fabricant предложили новую классификацию птичьих микоплазм. Авторы считают, что некоторые ранее описанные серологические типы микоплазм М. gallinarum тип В, М. anatis типы С, О, D, Р, Е, F, L имеют антигенное родство. На основании биохимических и серологических исследований они полагают, что в настоящее время имеется 12 серологических типов птичьих микоплазм.
Для дифференциации микоплазм, выделенных от свиней, D. Schimmel, Th. Hubrig рекомендуют реакцию агглютинации и пробу задержки роста. Этими реакциями авторы установили 5 серологических типов свиных микоплазм.
В настоящее время от крупного рогатого скота выделяют большое количество микоплазм, относящихся к различным серологическим группам. По данным R. Leach, от крупного рогатого скота выделено 8 серологических типов микоплазм, а по классификации J. Al-Aubaidi, Л. Fabricant — 13, из которых только у пяти серологических групп определена их видовая принадлежность.
Для постановки различных серологических реакций необходимо иметь активные специфические антисыворотки и антигены. Предложено большое количество схем приготовления гипериммунных сывороток и антигенов.
Е. Клинебергер-Нобель рекомендует следующий метод получения антигена.
На дно конической колбы объемом один литр вливают 15 мл расплавленного агара, приготовленного на мясном бульоне (или из экстракта сердца крупного рогатого скота) и обогащенном 5 мл сыворотки лошади. Затем вливают 500 мл жидкой среды (триптический перевар сердца крупного рогатого скота, к которому добавлено 20% сыворотки и 10% дрожжевого экстракта). Выбор сыворотки зависит от вида микоплазм, используемого для приготовления антигена. Для антигенов, предназначенных для гипериммунизации кроликов, следует использовать сыворотку крови кроликов. С этой целью штаммы микоплазм предварительно адаптируют к питательной среде, к которой добавлена сыворотка кролика. Колбу с питательной средой засевают суточной бульонной культурой, выращивают ее при температуре 37° в течение 5—6 суток. Затем проверяют па чистоту роста, фильтруют через марлю и центрифугируют при 8500 об/мин в течение 30 минут. Осадок промывают физиологическим раствором и ресуспендируют в 18 мл физиологического раствора.
Антиген вводят кроликам с интервалом 48 ч внутривенно в дозах 1; 1; 2; 2; 4 и 5—6 мл. Через 8 дней после последней инъекции берут кровь, и если активность сыворотки недостаточна, то инъекции культуры повторяют.
D. Taylor-Robinson и др.) готовят антиген для иммунизации кроликов и морских свинок путем выращивания микоплазм на средах, приготовленных из отвара мяса морских свинок.
К питательным средам добавляют холестерол или 5% сыворотки крови кроликов или морских свинок. Культивирование проводят в течение 8—10 дней при 37°. Культуру центрифугируют при 20 000 об/мни 30 минут. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе из расчета 1:10 к исходному объему. Половину антигена смешивают с полным адъювантом, а половину — с неполным адъювантом Фрейнда.
Животным вводят 1 мл антигена с полным адъювантом и 1 мл с неполным адъювантом внутрикожно в различные участки тела. Через 3 недели интраперитонеально вводят 1 мл культуры и через неделю животных обескровливают. Для морских свинок схема иммунизации та же, лишь доза антигена уменьшена до 0,5 мл.
З.П. Федорова с соавт. выращивали микоплазмы от птиц в культуре клеток куриных фибробластов 5—6 дней, затем культуру центрифугировали и концентрировали суспензию в 10 раз по отношению к исходному объему. Полученную бактериальную массу вводили кроликам внутривенно по 3 дня подряд с 4-дневными перерывами в течение 8 недель. В первую педелю доза составляла 0,5 мл, а в последующие недели вводили 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 и 2,5 мл. Всего кролику инъецировали 33,75 мл антигена. Обескровливание производили через 7 дней после последней инъекции. Антисыворотки хранили при -20°.
Согласно схеме О. Plescia и др., бульонную культуру микоплазм центрифугируют, отмывают и концентрируют. Полученную суспензию смешивают с равным количеством адъюванта Фрейнда и вводят кроликам по 0,5 мл в подушечку задней ланки внутрикожно и одновременно 0,5 мл внутримышечно и бедро той же лапки. Спустя неделю инъекцию антигена повторяют только в другую лапку; па третью неделю антиген вводят в первую лапку. Для первых двух циклов антиген концентрируют в 250 раз, а для третьего цикла — в 500 раз.
Схема иммунизации кроликов по R. Lemcke комбинированная. Исходную культуру концентрируют в 100 раз. В первые две инъекции смесь равных количеств антигена с полным адъювантом Фрейнда в объеме 4 мл вводят подкожно в боковые части живота в несколько точек. Интервал между инъекциями 3 недели. В последующем антиген вводят в дозах 1; 1; 2; 2; 4 и 6 мл внутривенно через день. Всего кролику вводят 20 мл антигена.
Е. Stanebringe, L. Hayflick антиген в равном объеме с полным адъювантом Фрейнда вводят кроликам подкожно по 0,1 мл в десять точек туловища. Через 4 и 6 педель после первого цикла антиген вводят внутривенно в дозе 1 мл, через 8 недель после первой инъекции вводят внутримышечно 1 мл смеси, состоящей из равных частей антигена и полного адъюванта Фрейнда, и 1 мл — внутривенно.
Для дифференциации микоплазм, выделенных от свиней, С. Dinter и др. использовали следующую схему иммунизации кроликов. В 200 мл питательной среды вносят 10 мл посевного материала и через 2—3 дня бульонную культуру центрифугируют при 35 000 g в течение 30 минут, трижды отмывают стерильным изотопическим раствором хлористого натрия. Осадок ресуспендируют в 10 мл физиологического раствора, суспензию смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводят по 2 мл в подушечки каждой конечности кролика. Через 5—6 недель инъекцию повторяют, по без адъюванта (доза 1 мл).
D. Schimmel получал активные сыворотки против птичьих, свиных и бычьих микоплазм, используя следующую схему гипериммунизации кроликов. Сконцентрированный и 100 раз антиген вводили внутривенно в первый день 0,5 мл, во 2, 3, и 4-й дни — по 1 мл, в 5, 6, 7 и 14-й дни — по 2 мл. Через 3 недели проводили пробное кровопускание. При недостаточных титрах антител цикл инъекций повторяли.
Японские исследователи In Jen Pan, М. Ogata для получения антигена выращивали микоплазмы в колбах в течение 5—7 дней, культуру фильтровали через марлю и центрифугировали при 15 000 об/мин 60—100 минут. Осадок трижды промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором. На этом же растворе готовили концентрированную в 20 раз суспензию микоплазм, которую вводили кроликам весом 2,5—3 кг внутривенно с интервалом в 48 часов по 1; 1; 2; 2; 2 и 2 мл. Последнюю порцию антигена (2 мл) смешивали с равным объемом адъюванта Фрейнда и инъецировали подкожно в подушечки лап. Кровь от кроликов исследовали еженедельно.
В основу метода иммунизации кроликов по В. Н. Петросовой с соавт. взята схема О. Plescia. Бульонные культуры 2—5-суточного роста центрифугировали при 6000—8000 g в течение 60 минут, трехкратно отмывали забуференным физиологическим раствором и смешивали с полным адъювантом Фрейнда. Антиген вводили по 0,025 мл в каждую подушечку лап кроликов (всего 0,1 мл) и по 0,9 мл внутрибрюшинно и в мышцу бедра еженедельно. Для первой л второй инъекций антиген концентрировали в 250, а для третьей — в 500 раз. Через 10 дней после третьей инъекции проводили пробное кровопускание, а через 3 недели кроликов полностью обескровливали.
J. Al-Aubaidi, J. Fabricant для приготовления антигена использовали 3-суточные бульонные культуры, которые центрифугировали при 15 000 об/мин 30 минут. Осадок дважды отмывали стерильным буферным физиологическим раствором. Антиген с полным адъювантом Фрейнда вводили кроликам-альбиносам в центр подушечек задних лап и в четыре точки спины по 0,2 и 0,5 мл в высшую и нижнюю точки правого и левого плечевого мускулов. Через 22 дня антиген вводили в правые и левые плечевые и бедренные мышцы по 0,5 мл.
L. Potgietcr выращивал культуры микоплазм в шуттель-аппарате 24—36 часов, затем центрифугировал при 22 000 об/мин 30 минут, дважды промывал в изотоническом солевом растворе и вводил антиген 6 раз с недельным интервалом различным животным: кроликам — 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 3,0 мл, петухам — 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 4,0 и 3,0 мл, индюкам — 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 8,0; 8,0 мл и поросятам — 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 22,0 и 30,0 мл.
В.Н. Икоев с соавт. получали гипериммунные сыворотки от кроликов по следующей схеме: 10 мл 2—3-суточной культуры вносили в 1 л питательной среды и культивировали в течение 7 дней. Культуру центрифугировали при 20 000 об/мин в течение 45 минут, промывали физиологическим раствором в объеме 1 л и осадок ресуспендировали в 7,5 мл. Антиген с полным адъювантом Фрейнда вводили кроликам внутримышечно по 2 мл с промежутками 7 дней, а через 12 дней с интервалами в 3—4 дня — внутривенно без адъюванта по 0,2, 0,3, 0,5 и 0,6 мл. Полученные сыворотки использовали для постановки реакции связывания комплемента.
Большинство авторов в своих работах не сообщают о результатах сравнительного изучения различных схем иммунизации лабораторных и сельскохозяйственных животных. Такие данные имеются лишь в отдельных работах. З.П. Федорова с соавт. пришли к выводу, что при иммунизации кроликов культурами микоплазм, выделенными от птиц, наиболее активные сыворотки получаются при использовании схем но R. Lemeke и О. Pleacia.
Я.Р. Коваленко с соавт. для получения специфических гипериммунных сывороток использовал различные схемы гипериммунизации кроликов; но Клинебергер-Нобель, D. Schimrnel, Th. Hubrig, В.Н. Петросовой с соавт., J. Al-Aubaidi, J. Fabricant. Наиболее активные сыворотки были получены при применении схемы по J. Al-Aubaidi, J. Fabricant с введением еще одного дополнительного цикла.
Многие авторы считают, что для получения активных агглютинирующих сывороток необходимо провести 6—10 внутривенных инъекций антигена, а для приготовления сывороток, активных в реакции ингибиции роста, — 40 инъекций антигена. По данным Н. Morton, P. Roberts, интенсивное образование антител происходит при введении антигена с адъювантом, причем особенно интенсивно антитела образуются в том случае, когда антиген первый раз вводили в небольшом количестве в подушечки задних конечностей кроликов. Агглютинины в сыворотке крови кроликов обычно появляются на 7-й день, а антитела, ингибирующие рост, — на 14-й день.
Реакция агглютинации. Впервые эту реакцию для типизации микоплазм использовала Е. Клинебергер в 1938 г. Приготовление антигена для постановки реакции агглютинации представляет определенные трудности, так как нередки случаи спонтанной агглютинации антигена.
Пробирочная реакция агглютинации. Нa физиологическом растворе готовят серийные разведения сывороток (гипериммунных — при типизации микоплазм, от больных или переболевших животных — при диагностике микоплазмоза). К приготовленным разведениям сыворотки добавляют 1—2 капли концентрированного антигена, и пробирки помещают в термостат или водяную баню при температуре 37—38° на 2—4 часа, а затем на 16—18 часов — в прохладное место или холодильник. В положительных случаях на дне пробирки образуется типичный агглютинат, который напоминает зонтик или сморщенную кожицу. Отстоявшаяся жидкость прозрачна. При осторожном встряхивании осадок поднимается в виде крупных трудно разбивающихся хлопьев. В отрицательных случаях жидкость равномерно мутноватая; иногда на дне пробирки образуется осадок в виде пуговицы.
D. Schimmel, Th. Hubrig, D. Schimmel, A. Pustovar использовали реакцию агглютинации для типизации культур микоплазм, выделенных от свиней, и подтвердили результаты, полученные С. Dinter и др. в реакции ингибиции роста и реакции преципитации об идентичности SEP-агепта и М. hyorhinis. Кроме того, они установили дополнительно еще пять серотипов, которые окончательно не удалось типизировать из-за отсутствия референтных штаммов микоплазм, выделяемых от свиней.
Для диагностики микоплазмозов крупного рогатого скота и типизации культур микоплазм, выделяемых от них, реакция агглютинации, пока не приобрела большого распространения.
Пластинчатая реакция агглютинации с сывороткой крови. На предметное стекло наносят каплю неразведенной или разведенной сыворотки и смешивают ее с каплей антигена. Стекло слегка покачивают, иногда подогревают до 37—38° и учитывают реакцию. G. Nagi считает, что реакцию агглютинации на стекле следует учитывать через одну минуту, Н. Gerlach — с сывороткой кур через 2, а с сывороткой индеек через 3 минуты. Н. Adler, W. Sadler учитывают реакцию через 4 минуты. Г.А. Грошева рекомендует производить учет реакции через 2 минуты.
Th. Hubrig, D. Schimmel, D. Schimmel, A. Pustovar, Р.В. Душук, В.П. Бердник рекомендуют использовать пластинчатую реакцию агглютинации для типизации культур микоплазм, выделенных от свиней при энзоотической пневмонии.
Пластинчатая кровекапельная реакция агглютинации рекомендуется для постановки диагноза на микоплазмоз в больших стадах птиц. Реакция агглютинации со свежей кровью проводится аналогично исследованию па пуллороз. Нa предметное стекло наносят каплю микоплазменного антигена и к ней добавляют каплю свежей крови. Через 2 минуты учитывают реакцию. В положительных случаях по краям капли образуются крупные хлопья; в отрицательных — капля остается неизмененной.
Кровекапельная реакция агглютинации используется для диагностики микоплазмоза птиц.
S. Tripaty и др. ставили пластинчатую реакцию агглютинации с цельной кровью павлинов. Реакцию учитывали в течение 2 минут. Этой реакцией удалось выявить наличие антител у 72,4% павлинов; у 7% были клинические признаки болезни.
Реакция агглютинации с яичным желтком. Этот метод впервые предложили и опробовали в Голландии М. Devos и др., A. Voeten и др. при обследовании стад кур па наличие респираторного микоплазмоза. Для этого берут 1 мл яичного желтка и смешивают его с 1 мл физиологического раствора; тщательно встряхивают. На предметное стекло наносят каплю полученной суспензии и смешивают ее с каплей микоплазмозного антигена. Реакцию учитывают через 2 минуты. В положительных случаях образуются крупные хлопья, в отрицательных — смесь остается равномерно мутной.
A. Cakala, S. Wisnewski применили реакцию агглютинации с куриным желтком для постановки диагноза па микоплазмоз. Реакцию учитывают через 2—3 минуты. Авторы считают эту реакцию менее чувствительной по сравнению с реакцией агглютинации па стекле, однако реакция агглютинации с куриным желтком позволяет выявить в стаде большой процент больных кур, не травмируя их фиксацией и отловом.
Реакция агглютинации с латексом. В качестве антигена используют латекс, нагруженный антигеном из микоплазм. Реакция латекс-агглютинации имеет то преимущество, что у частиц латекса, нагруженных антигеном, отсутствует спонтанная агглютинация, и антиген может храниться в условиях холодильника в течение 70 Дней. При сравнительном исследовании в различных серологических реакциях сывороток крови коров, экспериментально зараженных микоплазмами, наилучшие результаты были получены в реакции агглютинации с латексом.
Н. Morton нагружал суспензию стандартных частиц латекса диаметром 0,8 мкм взвесью микоплазм при комнатной температуре, после чего стабилизировал глицериновобуферным раствором pH 8,2, содержащим 0,2% альбумина крупного рогатого скота. Полученный антиген смешивал с равным объемом исследуемой сыворотки, разведенной тем же стабилизатором. Пробирки встряхивали, выдерживали час при 42°, центрифугировали и просматривали под 50-кратным увеличением микроскопа. В результате была получена четкая агглютинация, аналогичная агглютинации со взвесью микоплазм, однако расход антигена был в 10 раз меньше. Реакция агглютинации с латексом оказалась более чувствительной, чем реакция преципитации и проба задержки роста. С помощью этой реакции было выявлено антигенное родство между различными видами и штаммами микоплазм.
Проводя сравнительное изучение различных серологических реакций для идентификации микоплазм, большинство исследователей считают пробирочную реакцию агглютинации по сравнению с пластинчатой более чувствительной. Пробирочная реакция агглютинации позволяет путем титрования качественно определять состояние иммунитета. Из пластинчатых методов наиболее чувствительной считают реакцию агглютинации на стекле с сывороткой. Однако, по данным К. Fritzsche, К. Ando и др., наоборот, реакция агглютинации со свежей кровью более чувствительна.
Многие исследователи отмечают, что реакция агглютинации по чувствительности не уступает реакции связывания комплемента, однако антигены, приготовленные из микоплазм, нередко дают спонтанную агглютинацию, а в ряде случаев могут быть неагглютинабильными.
Н. Adler, A. Da Massa установили, что при постановке реакции агглютинации с сыворотками крови иммунизированных кур титр агглютининов повышался на 2—3 разведения, если к капле разведенной антисыворотки добавляли каплю инактивированной при 56° в течение 30 минут нормальной сыворотки кур. Таким же свойством обладали сыворотки крови индеек и кроликов.
Ph. Halen, P. Schyns провели сравнительное изучение 18 антигенов из микоплазм в быстрой и медленной реакции агглютинации и установили, что пять из них не соответствовали требованиям, предъявляемым к антигенам для реакции агглютинации.
N. Dzu, D. Schimmel рекомендуют в качестве ориентировочного метода использовать реакцию микроагглютинации. Для постановки этой реакции они брали бульонную культуру микоплазм и просматривали в фазовом контрасте под микроскопом. Затем к капле этой культуры добавляли каплю антисыворотки, помещали во влажную камеру на 2 часа и вновь просматривали под фазовым контрастом. В положительных случаях наблюдали образование агглютината. Недостатком этого метода является то, что в старых культурах нередко образуются крупные конгломераты и микроколонии, которые препятствуют и затушевывают агглютинацию.
Реакция гемагглютинации. Было замечено, что бульонные культуры микоплазм обладают способностью агглютинировать эритроциты кур. Эта реакция используется для дифференциации М. gallisepticum от М. gallinarum. Готовят разведения культуры от 1:2 до 1:64 и к 0,2 мл разведения добавляют 0,2 мл 2—4%-ной суспензии эритроцитов кур. Смесь выдерживают при комнатной температуре и учитывают результаты через 30 минут. На гемагглютинирующую способность культур влияют различные факторы, в том числе состав среды и длительность пассирования па бесклеточных питательных средах. Большое влияние оказывает также пептон, используемый для приготовления питательных сред. По данным D. Schirnmel, лучшие результаты гемагглютинации получаются при pH питательной среды 5,5.
S. Tripaty и др. при постановке реакции гемагглютипации использовали 0,5%-ную взвесь эритроцитов цыплят. Реакцию ставили с 5-суточиой культурой микоплазм, выделенной от павлинов. Результаты реакции учитывали ежечасно в течение 3 часов.
Недостатком этой реакции является то, что некоторые партии сред (бульоны Мартена, Xornmrepa и Эдварда) обладают гемагглютинирующей активностью. Кроме того, гемагглютинирующая активность культур микоплазм непостоянна и при длительном культивировании на бесклеточных питательных средах она снижается или полностью утрачивается.
S. Sato и др. предложили свою модификацию реакции гемагглютинации. Выросшие па пластинчатом агаре колонии микоплазм покрывают 0,3%-ной суспензией эритроцитов кур и оставляют па. 15 минут при комнатной температуре. Затем избыток эритроцитов сливают, колонии осторожно дважды промывают физиологическим раствором И просматривают их под 50-кратным увеличением микроскопа. На колониях штаммов микоплазм, обладающих гемадсорбирующими свойствами, адсорбируются куриные эритроциты.
Реакция задержки гемагглютинации основана на способности гомологичных антисывороток подавлять гем-агглютинирующую активность того или иного штамма микоплазм. Предварительно перед постановкой реакции производят титрацию бульонной культуры, которую используют в качестве антигена. Затем готовят разведения сыворотки с 1:2 до 1:64 и добавляют к ним равное количество бульонной культуры микоплазм, выдерживают 20 минут при комнатной температуре и добавляют суспензию эритроцитов. Смесь выдерживают 30—45 минут при комнатной температуре и учитывают результаты.
Т. Hubrig испытал реакцию задержки гемагглютинации при диагностике микоплазмоза птиц и полагает, что реакция достаточно специфична и является дополнением к реакции агглютинации. Эта реакция может быть использована для контроля за состоянием птиц, подвергающихся иммунизации, и яйца которых пойдут в дальнейшем для инкубации. М.Т. Прокофьева с соавт. использовала реакцию задержки гемагглютинации для оценки эпизоотического состояния птицеводческих хозяйств. При сравнительных серологических исследованиях было показано, что реакция задержки гемагглютинации является наиболее чувствительным тестом, чем другие серологические реакции.
Н. Kunijazu и др. установили, что у экспериментально зараженных цыплят максимальное образование антител, задерживающих гемагглютинацию, происходит через 7 недель, а через 13 недель они уже в сыворотках крови цыплят не обнаруживались. Более быстрому исчезновению из крови антител, задерживающих гемагглютинацию, способствуют введение тилозина.
Реакция косвенной гемагглютинации. В этой реакции обычно используют отмытые эритроциты животного, в том числе птицы, которые затем нагружают растворимым или корпускулярным антигеном. Косвенную реакцию гемагглютинации использовали для определения М. hyorhinis, для диагностики энзоотической пневмонии, вызываемой М. hyopneumoniae. Для этой цели культуры микоплазм выращивали в течение 5 дней в 500 мЛ питательной среды, центрифугировали 30 минут при 35000 g, дважды промывали забуференным физиологическим раствором (pH 7,2) и ресуспендировали в 5,5 мл деионизированной воды. Антиген хранили при -20°. К концентрированной суспензии микоплазм добавляли, 2%-ный раствор лаурилсульфата натрия, чтобы конечная концентрация его в суспензии составляла 0,2%, и проводили диализ против 5 M раствора сульфата аммония (pH 8,0). Осадок отделяли центрифугированием при 600 g в течение 15 минут и диализовали против фосфатного буферного физраствора в течение 72 часов. Антиген консервировали мертиолатом 1:10000 и хранили при 4°.
Эритроциты свиней трижды центрифугировали при 250 g в фосфатном буферном физиологическом растворе. К 1 мл отмытых эритроцитов добавляли 80 мл дубильной кислоты (1:40000), инкубировали в водяной бане при 37° в течение 15 минут, осаждали при 590 g, один раз промывали в фосфатном буферном растворе хлористого натрия и готовили 10%-ную суспензию.
К 0,5 мл 10%-ных таннизированных эритроцитов добавляли 0,3 мл антигена и 2 мл буферного физраствора (pH 6,4). Смесь инкубировали в водяной бане при 37° 20 минут, эритроциты осаждали при 350 g 5 минут, отмывали в фосфатном буферном физиологическом растворе и готовили 1%-ную взвесь эритроцитов. Эти эритроциты использовали в качестве антигена.
В U-образном сосуде, готовили разведения сывороток и к 0,05 мл добавляли 0,025 мл эритроцитов, нагруженных антигеном. Смесь встряхивали и помещали в водяную баню при 37° на 60 минут, после чего учитывали реакцию.
Проба задержки роста (реакция ингибиции роста). Впервые реакцию ингибиции роста предложили D. Edward, W. Fitzgerald в 1954 г. В дальнейшем она подвергалась различным модификациям. Для постановки реакции нужно иметь достаточно специфические и высокоактивные гипериммунные сыворотки.
Реакцию задержки роста ставят к жидкой или полужидкой питательной среде или на пластинчатом агape. Для этого к замеренному объему элективной питательной среды с сывороткой крови лошади и дрожжевым экстрактом добавляют определенное количество стерильной антисыворотки и делают серийные двукратные разведения. Затем в среду добавляют исследуемую культуру, содержащую 10в3—10в6 колониеобразующих единиц. Питательную среду помещают в термостат и инкубируют в течение 48—120 часов. По степени помутнения среды определяют наличие специфических антител.
Реакцию ингибиции роста на плотной среде ставят следующим способом. В чашки Петри разливают элективную сывороточную плотную питательную среду, проверяют в течение суток на стерильность при температуре 37°. На поверхность подсушенного агара наносят 0,2 мл исследуемой бульонной культуры микоплазм и равномерно растирают по всей поверхности. Чашки оставляют в термостате при 37° или на 60 минут при комнатной температуре для подсушивания, и затем на агар накладывают диски из фильтровальной бумаги, смоченные гипериммунными сыворотками и нормальной сывороткой. Можно делать в агаре лунки и в них вносить определенное количество исследуемой антисыворотки, однако в этом случае потребуется значительно большее количество сыворотки.
После выращивания в условиях термостата (3—7 дней, в зависимости от скорости роста исследуемых культур) измеряют зону задержки роста вокруг дисков и по величине этой зоны судят об активности антисывороток.
Е. Stenebring, L. Heyflick рекомендуют наносить на стерильные диски 0,02 мл аитисыворотки и высушивать их при температуре 5° над хлористым кальцием или кремнистым гелием. Диски, пропитанные сывороткой, храпят при -20°; активность сывороток на этих дисках сохраняется до 7 месяцев.
В своих исследованиях мы ставили реакцию задержки роста на пластинчатом агаре Мартена, к которому добавляли 20% сыворотки крови лошади, 10% дрожжевого экстракта, 1:2500 ацетата таллия и 300 ЕД/мл пенициллина. Четырехсуточные бульонные культуры микоплазм засевали по 0,2 мл на поверхность агара для получения равномерного роста. Чашки оставляли при комнатной температуре па 60 минут и па агар накладывали диски из фильтровальной бумаги, смоченные той или иной антисывороткой. Контролом служили аналогичные диски, смоченные сывороткой неиммунного кролика. Засеянные микоплазмами чашки укладывали в полиэтиленовый мешок и помещали в термостат при температуре 38°, где их выдерживали 5—7 суток.
Для исследования были взяты трехкратно клонированные культуры М. mycoides var. mycoides, A. laidlawii, A. granularum, М. bovigenitalium, М. arginini, М. mycoides var. capri, M. agalaetiae, нолевые штаммы от овец (139, 96 и 166), полевые штаммы от свиней (67, 69 и 71), М. gallisepticum, М. gallinarum, М. iners, штаммы микоплазм, изолированные из сыворотки крови крупного рогатого скота (полученные из Государственного контрольного института имени Л.А. Тарасовича), а также 11 штаммов микоплазм, выделенных нами из носовой слизи и легких телят, больных респираторными болезнями. Всего исследовано 43 культуры.
В опытах использовали сыворотки крови, полученные от кроликов путем гипериммунизации указанными антигенами по схеме J. Al-Aubaidi, J. Fabricant.
Исследованиями установлено, что приготовленные нами сыворотки были достаточно активны и специфичны. Культуры М. arginini (штамм 1510), М. bovigenitalium (штамм 1509) имели общий антиген, вследствие чего при перекрестной реакции наблюдали взаимную задержку роста, а М. mycoides var. capri (штаммы C1 и C2) имели серологическое родство с М. mycoides v. mycoides. Из шести имевшихся у нас штаммов М. gallisepticum пи один не ингибировался антисыворотками A. laidlawii. Штаммы 17в и 60168, выделенные из сыворотки крупного рогатого скота, нами определены как A. laidlawii.
Полевые штаммы микоплазм, которые были выделены от свиней и телят, больных бронхопневмониями, составляли самостоятельные серологические группы, также как культуры 1512 (по Личу тип I), М. agalactiae, М. gallinarum, М. iners и М. gallisepticum.
И.В. Раковская, С.В. Прозоровский, Г.М. Бочко, В.И. Петросова с соавт. рекомендуют проводить титрацию сывороток по степени подавления роста колоний микоплазм в полужидкой питательной среде. Готовят различные разведения нормальной и гипериммунной сывороток на физиологическом растворе, 0,2 мл различных разведений сывороток смешивают с 0,2 мл культуры с различным содержанием колониеобразующих единиц (КОЕ). После выдерживания смеси при комнатной температуре к ней добавляют 1,6 мл 0,3%-ного агара и помещают в термостат на 72—96 часов. За титр ингибирования авторы принимают 75—100%-ное подавление роста. Они считают реакцию ингибиции роста наиболее приемлемым методом для таксономической идентификации микоплазм.
Кроме этих основных методов, для постановки реакции ингибиции роста применяют ряд модификаций, сущность которых заключается в разнообразии засева культур и контакта микоплазм с антисыворотками.
По мнению большинства исследователей, реакция ингибиции роста в жидкой или плотной питательной среде является специфичной, и она может быть использована как основной тест при серологической типизации микоплазм. Именно при помощи этой реакции удалось типировать птичьи и свиные штаммы микоплазм, выделенные в различных странах мира.
Механизм этой реакции пока не изучен, однако предполагают, что в основе ее лежит бактериостатическое действие антисывороток, проявляющееся только в присутствии комплемента.
Реакция ингибиции метаболизма. О применении реакции ингибиции метаболизма впервые сообщил R. Purcell на втором симпозиуме по биологии микоплазм, состоявшемся в 1968 г. Этот метод основан на изменении окраски среды, к которой добавлен соответствующий индикатор, вследствие либо сбраживания микоплазмами углеводов, либо расщепления мочевины, либо восстановления хлористого тетразолия.
По данным Н. Chu, Н. Gerlach, реакцию иигибиции метаболизма можно применять для выявления антител к М. gallisepticum в сыворотках крови больных кур; М. Gois использовал ее для установления антигенной взаимосвязи между выделенными от свиней культурами микоплазм.
Н. Fridrich испытывал специфичность реакции ингибиции метаболизма с М. hyorhinis. Питательной средой для реакции служил бульон Адлера, к которому добавляли 1% глюкозы, 1% мальтозы, 2,3,5-трифенил-тетразольхлорид 1:3333 и фенолрот 1:500.
В пробирки разливали по 0,9 мл питательной среды и но 0,9 мл антисыворотки в двукратных разведениях до конечного разведения 1:16. Затем во все пробирки засевали по 0,2 мл культуры микоплазм, содержащей и 1 мл 10в6,5 микроорганизмов.
Гомологичные сыворотки задерживают репродукцию микоплазм, вследствие чего сахара и хлористый тетразолий остаются неизмененными. Если сыворотка не ингибирует рост микоплазм, то микробы расщепляют тот или иной добавленный в среду ингредиент и среда изменяет цвет.
В реакции ингибирования метаболизма различают 2 фазы: фазу первоначального ингибирования, которая наблюдается также в контрольной пробе, содержащей одни микоплазмы (она не зависит от их дозировки и сопровождается изменением pH на 0,5 сразу же после внесения микоплазм), и фазу конечного ингибирования метаболизма. Отмечается значительное изменение pH среды под влиянием иммунной сыворотки; титры ее зависят от дозы микоплазм, и результаты остаются стабильными, несмотря на длительность инкубации. Титрование обычно проводят, используя различные дозы микоплазм при постоянном количестве иммунной сыворотки.
Реакция угнетения обмена как серологическая реакция основана на явлении угнетения обмена веществ микоплазм, однако при этом не происходит значительной задержки роста микроорганизмов. Точное объяснение этого явления в настоящее время отсутствует. R. Purcell и др. считают, что задержка антителами угнетения обмена веществ должна происходить на оболочке микоплазм после внедрения антител в определенных местах внутрь клеток. По их мнению, антитела ингибиции метаболизма и антитела ингибиции роста относятся к одной группе антител, т. е. они являются только количественным выражением одного и того же явления. Однако выдвигаемое этими учеными положение еще точно не доказано.
По данным R. Purcell и др., G. Kenny, Н. Fridrich, фактор, вызывающий ингибицию обмена, термолабилен, а чувствительность реакции увеличивается при добавлении сыворотки крови морских свинок. Этот фактор отнесен к бета-глобулину, не связанному с антителами.
При постановке этой реакции необходимо учитывать возможность неспецифических показаний из-за недостаточной адаптации к питательной среде вновь выделенных культур микоплазм и наличия лабильных факторов в сыворотке.
Реакция связывания комплемента. Реакцию связывания комплемента для типизации микоплазм использовали D. Card, Н. Keller, Е. Клинебергер-Нобель и другие исследователи.
Е. Клинебергер-Нобель предлагает следующий метод приготовления антигена для постановки реакции связывания комплемента. На жидкой питательной среде выращивают культуру микоплазм в течение 5—7 дней, центрифугируют ее при 8500 об/мин в течение 30 минут. Осадок ресуспендируют в 80 мл нормального физиологического раствора, делят па 2 части и вновь центрифугируют. Одну часть ресуспендируют в 10—12 мл физраствора, добавляют мертиолат 1:10000. Эту часть называют F-антигеном. Вторую часть также суспендируют в 10—12 мл дистиллированной воды, кипятят в солевой ванне при температуре 108° в течение 10 минут, добавляют 0,85% хлористого натрия и мертиолат 1:10000. Эту фракцию называют В-антигеном.
В.Н. Петросова с сотр. использовала в PCK корпускулярный (трижды отмытые центрифугированием бульонные культуры и сконцентрированные в 100 раз) и растворимый антигены (фракция С). Последний представлял собой отмытую взвесь микоплазм, сконцентрированную в 100 раз и разрушенную в течение 10 минут ультразвуком. После озвучивания суспензию центрифугировали при 8000—10 000 g в течение 20—30 минут. Полученную слегка опалесцирующую жидкость, обозначенную как С-фракцию, использовали в РСК. Антигены консервировали мертиолатом.
З.П. Федорова с соавт. готовила антиген трех видов: корпускулярный, растворимый и тканевый. Для корпускулярного антигена культуры трижды промывали физиологическим раствором и концентрировали в 50 раз. Растворимый антиген получали из корпускулярного путем 10-кратного замораживания при -70° с последующим оттаиванием и центрифугированием при 6000 об/мин в течение 50 минут. Прозрачную надосадочную жидкость использовали как антиген. Тканевый антиген был приготовлен па куриных фибробластах после заражения монослоя клеток M. gallisepticum. Материал концентрировали центрифугированием в 10 раз.
Для снятия прокомплементарной активности антиген обрабатывали нативным комплементом морской свинки из расчета 1:10, выдерживали в водяной бане при 37° is течение 2 часов и 18 часов при комнатной температуре, после чего антиген инактивировали в водяной бане при 56° 30 минут.
Е. Клинебергер-Нобель, В.Н. Петросова с соавт. рекомендуют ставить реакцию связывания комплемента на холоде. Для этого пробирки, содержащие физраствор, комплемент и антиген (для титрования комплемента) и пробирки с разведением сывороток, комплементом и антигеном (для основной реакции) выдерживают при 4° 18 часов и 1 час при комнатной температуре, затем добавляют гемолитическую систему и помещают в водяную баню при 37° на 30 минут (Е. Клинебергер-Нобель). В.Н. Петросова с соавт. рекомендует выдерживать смесь в водяной бане до полного лизиса эритроцитов в контролях испытуемых сывороток и антигенов, просматривая их каждые 20 минут.
Е. Клинебергер-Нобель отмечает, что большинство антисывороток, полученных на кроликах и морских свинках, давало неспецифические реакции в разведениях 1:40—1:160. Неспецифических реакций не наблюдали с сыворотками крови человека и белых крыс даже в высоких концентрациях (1:10).
З.П. Федорова с соавт. считает, что для постановки реакции связывания комплемента с целью типизации микоплазм, выделенных от птиц, лучше использовать растворимые антигены. М. Fray, С. Torpe с помощью PCK установили самостоятельные серотипы М. gallisepticum, М. meleagridis и М. synoviae и путем постановки большого количества перекрестных реакций — 16 серотипов птичьих микоплазм.
В.Н. Икоев с соавт. обследовал с помощью PCK кровь 330 японских перепелов в трех хозяйствах и установил, что антитела отсутствуют или имеются в небольших титрах и хозяйствах, в которых перепела не имели контакта с курами. В Зеленоградском хозяйстве, где перепела имели контакт с курами, обнаружены антитела к М. galliseplicum у 20,3%, к М. gallinarum у 14,5% и к М. iners у 8,8% птиц из всего обследованного поголовья.
P. Boulanger, С. L’Ecuyer, I. Takatori и др. применили реакцию связывания комплемента для диагностики энзоотической пневмонии свиней. Авторы считают, что эта реакция специфична и высокочувствительна. Антитела у свиней обнаруживаются в первые 2—3 недели после заражения. R. Hodges, A. Betts, Т. Fujikura и др. также получили хорошие результаты при использовании PCK для обнаружения комплементсвязывающих антител к М. hyopneumoniae у экспериментально зараженных и спонтанно больных свиней.
М. Eskildes, К. Schiring-Thisen применили реакцию связывания комплемента для определения антител к М. suipneumoniae. С этой целью они использовали не-прогретые и прогретые сыворотки крови свиней. Из шести сывороток от экспериментально зараженных поросят в четырех обнаружили специфические антитела. У контрольных (незараженных) поросят они не обнаружены.
В. Стоянов в реакции связывания комплемента типировал штаммы, выделенные от свиней при энзоотической пневмонии, и установил, что в Болгарии массовые пневмонии в основном вызываются М. granularum и М. hyorhinis.
У.А. Касумов для постановки реакции связывания комплемента готовил тканевые и культуральные антигены. Культуральный антиген получал путем смыва с агаровой культуры возбудителя агалактии, а тканевый — из водных экстрактов равных частей головного мозга и ткани вымени. При исследовании сывороток крови больных и переболевших агалактией животных с тканевым выменным антигеном (894 пробы) получены положительные результаты в 52—68% случаев. Эти же сыворотки, исследованные с антигеном, приготовленным из ткани вымени здорового животного, дали положительные результаты в 3,4% случаев.
Однако приготовление тканевого антигена затруднено тем, что нужно иметь овец с выраженной маститной формой агалактики. Кроме того, антиген, приготовленный из вымени, сохраняет свою активность только 12 дней. Исходя из полученных результатов, М.М. Фарзалиев и У.А. Касумов рекомендуют реакцию связывания комплемента в качестве подсобного метода лабораторной диагностики инфекционной агалактии овец и коз.
Реакция связывания комплемента давно используется для диагностики перипневмонии крупного рогатого скота. В качестве антигена применяют автоклавированный плевральный экссудат от больных животных.
Реакция преципитации. Реакцию преципитации с возбудителем перипневмонии крупного рогатого скота впервые описал Вите. R. Griffin в качестве антигена испытывал экстракты из легких и плеврального экссудата от больного перипневмонией крупного рогатого скота. Положительный результат был получен во всех случаях исследования антигенов от больных животных. Антигены, приготовленные из материалов 27 здоровых и одного вакцинированного животного, дали отрицательный результат.
Реакцию преципитации в агаровом геле используют для типизации штаммов микоплазм, выделенных от птиц. Антигены из культур М. gallisepticum образуют от 2 до 5 линий преципитации.
Для приготовления антигена, чувствительного в реакции преципитации в агаровом геле, D. Taylor-Robinson и др. выращивали культуру микоплазм в течение 8—10 дней в отваре из мяса кролика или морской свинки. Культуру центрифугировали при 20000 об/мин, осадок, полученный из 25 мл культуральной жидкости, ресуспендировали в 0,06 мл дистиллированной воды, замораживали и оттаивали 6 раз и хранили при -20°. В чашки Петри диаметром 5 см вливали 5 мл 1%-ного агара, делали шесть периферийных и одну центральную лупку, заливали реагенты и инкубировали при 33° во влажной камере.
D. Schimmel, A. Pustovar успешно использовали для серологической дифференциации A. laidlawii и A. granularum реакцию агглютинации и реакцию преципитации в агаровом геле. Н.Н. Камеледииова с соавт. изучала антигенный состав микоплазм, выделенных от птиц, методом иммуноэлектрофореза и делает заключение, что иммунофоретический анализ позволяет выявить, антигенный состав микоплазм. Пo ее данным, антиген из штамма М. gallisеpticum серотип А резко отличается oт других серотипов.
М.М. Фарзалиев, У. А. Касумов проверили возможность применения реакции преципитации в агаровом геле для диагностики инфекционной агалактии овец и коз. Реакцию ставили в чашках Петри и на предметных стеклах. Было установлено, что сыворотки крови 50—70% гипериммунизированных кроликов обладают высокой преципитирующей активностью, тогда как сыворотки крови овец оказались непригодными для постановки реакции. Наибольшее количество преципитиногена содержится в молоке, синовиальной жидкости, лимфатических узлах (предлопаточных и надвыменных) и в пораженной ткани вымени. Антигены, приготовленные из молока и синовиальной жидкости, взятых от экспериментально зараженных животных, давали постоянно положительные результаты.
Авторы исследовали сыворотки крови, молоко, синовиальную жидкость, экстракты тканей вымени и глаз (всего 698 проб) естественно больных агалактией овец и коз из 5 хозяйств. С антигенами из молока положительный результат получен в 64,51—76,83% случаев; из синовиальной жидкости — в 61,11—71,41; с экстрактом вымени — в 57,15—66,67 и из экстракта глазного яблока — в 33,34% случаев. Все материалы, взятые от здоровых овец, в реакции преципитации дали отрицательный результат. На основании проведенных опытов М.М. Фарзалиев и У.А. Касумов считают, что метод преципитации в агаровом геле является перспективным для лабораторной диагностики болезни.
Реакция иммунофлуоресценции. Для типизации микоплазм в последние годы широко начали применять метод иммунофлуоресценции. Впервые этот метод использовал Н. Liu для изучения возбудителя атипичной пневмонии людей (болезни Итона). В дальнейшем метод иммунофлуоресценции применяли для идентификации М. pneumoniae многие исследователи.
Получены положительные результаты при использовании метода прямой иммунофлуоресценции с колониями микоплазм, выращенными на агаровой среде. W. Clark и др. применили прямую реакцию флуоресцирующих антител для идентификации микоплазм в бульонных культурах и культуральной жидкости. J. Tully пришел к выводу, что метод прямой иммунофлуоресценции пригоден для идентификации микоплазм, выделяемых от мышей, a J. Masiga, A. Stoun, P. Perreau и др. успешно идентифицировали методом прямой иммунофлуоресценции М. mycoides V. mycoides, М. bovigenitalium, М. mycoides v. capri и другие штаммы, изолированные от сельскохозяйственных животных.
J. Al-Aubaidi и J. Fabricant провели исследования по приготовлению и использованию флуоресцирующих сывороток для идентификации микоплазм, выделенных от крупного рогатого скота. Антисыворотки они получали путем иммунизации кроликов по схеме, предложенной ими ранее. Гамма-глобулин метили изотиоционатом флуоресцеина общепринятым методом и использовали для окраски колоний микоплазм.
Культуры микоплазм высевали штрихом на пластинки с агаром и инкубировали 4 дня при 37°, затем вырезали агаровые блоки. На чистое предметное стекло колониями вверх помещали до восьми блоков из одной пластинки. Чтобы прикрепить блоки к стеклу, последнее смазывали смесью 65% воска и 35% вазелина. Меченый гамма-глобулин наносили на колонии, имеющиеся на поверхности агара, стекла помещали во влажную камеру и оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего конъюгат сливали, а стекло дважды промывали трис-буфером (pH 7,3). Для смыва солей стекло помещали в дистиллированную воду, избыток воды удаляли, па окрашенный блок наносили каплю заливочной среды (1 объем забуференного физраствора и 9 объемов глицерина, pH 7,2). Контролями в этих опытах служили отдельные блоки, обработанные неиммунными и иммунными сыворотками, а затем подвергшиеся окраске конъюгатом.
Этим методом удавалось выявлять колонии микоплазм при первичном выделении даже в тех случаях, когда колонии были плохо различимы в обычном световом микроскопе. Важно отметить, что перекрестных реакции между различными серотипами не наблюдалось. Наилучшие результаты получены при толщине агаровых блоков 2 мм с молодыми (2-3-дневными) колониями микоплазм.
Для постановки реакции иммунофлуоресценции D. Taylor-Robinson и др. переносили агаровые блоки с колониями па хорошо обезжиренное стекло, наливали каплю нормальной или иммунной кроличьей сыворотки, смешанной с комплементом морской свинки, после чего обрабатывали меченым флуорохромом антикроличьим глобулином.
P. Perreau и др. применили иммунофлуоресцентный метод для идентификации культур М. mycoides V. mycoides, М. mycoides var. capri, М. bovirhinis, М. bovigenitalium, M. agalactiae, A. laidlawii, M. galliseplicum S6.
На хорошо обезжиренных предметных стеклах готовили отпечатки колоний, фиксировали их парами осьмиевой кислоты в течение нескольких секунд и обрабатывали метанолом или жидкостью Буэна (5—10 минут).
Фиксированные препараты покрывали разведением конъюгата, на 30—45 минут помещали во влажную камеру при 37°, промывали и исследовали под микроскопом. Авторы считают, что прямой и непрямой методы флуоресценции позволяют обнаруживать возбудителя перипневмонии крупного рогатого скота как в питательных средах, так и в патологическом материале (экссудате из плевральной полости, гистосрезах из пораженных участков легких).
L. Potgieter, R. Ross использовали метод иммунофлуоресценции для идентификации М. liyorhinis и М. hyosynoviae. Конъюгаты глобулинов из сыворотки крови петухов, кроликов и свиней, иммунизированных М. hyorhinis и М. hyosynovae, окрашивали изотиоционатфлуоресцеином.
М. Д. Бродова с соавт. исследовали у детей наличие антител к М. pneumoniae и установили, что чувствительность метода иммунофлуоресценции по сравнению с другими серологическими методами составила 75%, а совпадение с серологическими методами исследования — 70%.
По данным К. Lewingston и др., при помощи метода иммунофлуоресценции удается обнаруживать микоплазмы в бронхиальном эпителии у поросят па 14—42-й день после заражения их культурой М. hyopneumoniae. Однако этот метод по сравнению с электронно-микроскопическими исследованиями был менее чувствительным.
Наряду с применением метода флуоресцирующих антител многие исследователи пытались использовать для обнаружения микоплазм окраску препаратов различными флуорохромами.
Следует отметить, что метод окраски флуорохромами, а также метод иммунофлуоресценции не нашли широкого применения при исследовании микоплазм вследствие трудоемкости и недостаточной специфичности. Неспецифичность метода, по-видимому, обусловлена тем, что при выращивании микоплазм должны использоваться обязательно сывороточные среды и из этих культур готовят антигены для иммунизации животных и препараты для исследования.
Антигенная структура микоплазм. Исследованиями показано, что микоплазмы имеют очень сложную антигенную структуру, которая боле^ или менее изучена у возбудителей перипневмонии крупного рогатого скота и атипичной пневмонии людей (М. mycoides var. mycoides, М. pneumoniae).
Еще в 1937 г. Т. Курочкин экстрагировал из суспензии М. mycoides углеводный компонент, обладающий способностью образовывать преципитат с антисыворотками и связывать комплемент. Антиген легко освобождался из клеток, и его обнаруживали в свободном состоянии в среде из старых бульонных культур и в крови заболевших животных. Вторая фракция, полученная авторами путем осаждения ледяной уксусной кислотой, была названа нуклеопротеином. Эта фракция была менее активна в реакции связывания комплемента и совсем неактивна в реакции преципитации.
В 1957 г. Е. Daffaala получил экстракт, напоминающий углевод Курочкина, названный фракцией А. Полученный препарат не относился к углеводам, не растворялся в спирте, обладал термостабильностью и активностью в реакции преципитации; он также адсорбировал агглютинины из антисывороток крупного рогатого скота, по был неактивен в реакции связывания комплемента. Углеводная фракция, полученная Т. Yoshida, была активна в реакции преципитации, по и реакции связывания комплемента не давала положительных результатов. Фракции же Б была активна как в реакции связывания комплемента, так и в реакции преципитации, но не выделялась в культуральную среду и жидкости организма. Химическая структура фракции Б не была и изучена, однако последняя осаждалась ацетоном из спиртового экстракта и, вероятно, содержала липид.
T. Yoshida показал, что комплементсвязывающая активность М. mycoides var. mycoides связана с клеточными липидами. Из трех фракций (углевода, белка и липида) только липид, экстрагированный эфиром и ацетоном, был активен в реакции связывания комплемента. Следовательно, антигенной активностью у М. mycoides var. mycoides обладает углевод, легко выделяющийся из клеток и активный в реакциях преципитации и связывания комплемента со специфическими антисыворотками; кроме того, имеется связанный с клетками компонент, который по своей природе ассоциируется с комплементсвязывающей активностью клеток.
Дальнейшие исследования показали, что полисахаридный гаптен М. mycoides var. mycoides, содержащий галактозу, небольшое количество глюкозы и 4% липида, можно экстрагировать теплым водным раствором фенола. Этот полисахаридный гаптен, названный галактаном, отличается от бактериальных липополисахаридов тем, что он не обладает токсичностью для кроликов, не вызывает у них повышения температуры и содержит меньше сахаров, фосфора, азота и липида. Это различие, возможно, объясняется отсутствием у микоплазм клеточной стенки. Галактан, полученный P. Plackett и др., не обладал способностью стимулировать у животных иммунитет, но был активен в реакции преципитации со специфическими антисыворотками. Он адсорбировал агглютинины и в присутствии непрогретой сыворотки крупного рогатого скота связывал комплемент антисывороток этого вида животных.
Исследованиями многих авторов показано, что в крови и в плевральном экссудате больных перипневмонией животных накапливается полисахаридный антиген, сходный с полисахаридным компонентом, полученным in vitro. Этот полисахарид, вероятно, объединяется с липидом, который имеется в экстрактах, полученных различными методами в различных количествах, и он обладает агглютинирующей и гемагглютинирующей активностью. Липидные компоненты клеток микоплазм, по-видимому, связаны с клеточной мембраной и экстрагируются из нее.
Другие гликопротеидные фракции можно получить из микоплазм или неочищенных препаратов галактана. Они также обусловливают комплементсвязывающую и гемагглютинирующую активность. Основные серологически активные компоненты М. pneumoniae обнаружены и липидных экстрактах. Было показано, что большинство липидов у М. pneumoniae локализуется в клеточной мембране и они получены путем обработки цельных клеток смесью хлороформа и метилового спирта 2:1 и ацетоном или обработки суспензий ультразвуком с последующим осаждением высокоскоростным центрифугированием. Полученные этими способами экстракты содержали основную долю комплементсвязывающего антигена цельных клеток, блокировали угнетающие рост антитела и реакциях ингибиции восстановления тетразоля и ингибиции роста на агаре. Вероятно, антигены, стимулирующие выработку антител, угнетающих рост, локализуются в основном у поверхности клеток микоплазм, это позволяет предполагать их происхождение из липидов клеточной мембраны. Липид, экстрагированный ацетоном, также блокировал антиген в реакции непрямой агглютинации, по не сенсибилизировал эритроциты. Ни один из экстрактов не был иммуногенен для лабораторных животных.
Результаты фракционирования неочищенных хлороформо-этаноловых экстрактов позволяют предполагать, что серологически реагирующие компоненты микоплазм не ограничены одной липидной фракцией. Предварительное фракционирование на колонках хлороформометаноловых смесей позволяет получить кислотные и некислотные фракции. Обе фракции были активными в реакции снизывания комплемента. Методом тонкослойной хроматографии у М. pneumoniae установлено семь различных компонентов, способных связывать комплемент в реакциях с гомологичными антисыворотками.
Была изучена серологическая активность липидов, полученных из клеток М. fermentans, М. hominis, М. pharyngis, М. orale (тип 1), М. orale (тип 2), М. salivarium, М. pulmonis и М. arthritidis и лишь у М. fermentans при экстрагировании смесью хлороформа-метанола обнаружены липиды, содержащие специфический, термостабильный, комплемeнтсвязывающий антиген. Липидные фракции из остальных 6 видов микоплазм обладали низком специфичностью и давали положительную PCK с гетерологичными антисыворотками. Высказывается предположение, что эти неспецифические липидные компоненты происходят из культуральной среды.
Таким образом, иммунохимический анализ нескольких видов микоплазм говорит о большом разнообразии антигенной структуры внутри этого рода. Так, у М. mycoides var. mycoides и у микоплазм, выделенных при артритах крупного рогатого скота, основными серологически активными компонентами являются полисахариды, в то время как у М. pneumoniae (а возможно, и у М. fermentans) большая доля серологической активности заключена в липидных фракциях, а у М. pulmonis основные комплементсвязывающие и преципитирующие антигены представлены белковыми комплексами.
В связи с тем, что у микоплазм отсутствует клеточная стенка, можно предполагать, что компоненты клеточной мембраны играют основную роль в антигенности этих микроорганизмов. Это в первую очередь относится к М. pneumoniae. Антигенная субстанция у микоплазм может находиться во внеклеточном слое слизи или капсуле. Предполагают, что такой слой может быть у М. mycoides. Разработка тонких методов электронной микроскопии позволит наблюдать реакцию антиген—антитело и поможет установить локализацию поверхностных антигенов.