Питательные среды, методы выделения и идентификации микоплазм
24.06.2015
Трудности выделения микоплазм и ахолеплазм из различных объектов постоянно вынуждали исследователей вести поиски наиболее оптимальных питательных сред для выделения и поддержания этих микроорганизмов. Однако недостаточная изученность пищевых потребностей и обменных процессов микоплазм и ахолеплазм очень осложняют и затрудняют решение этого вопроса. В настоящее время для выделения и культивирования этих микроорганизмов предложено огромное количество различных питательных сред. Подавляющее большинство их состоит из трех основных компонентов (питательная основа, дрожжевой экстракт, сыворотка или асцитическая жидкость) и отличаются друг от друга типом и методом их приготовления.
Длительное время исследователи, изучавшие перипневмонию крупного рогатого скота и инфекционную агалактию овец и коз, использовали для выделения и культивирования возбудителей этих болезней питательную среду, состоящую из бульона Мартена и лошадиной сыворотки. Несколько позже для этих целей начали использовать питательные среды, основой которых являлись различные типы ферментативного перевара животных тканей. Такие питательные среды были использованы Н. Schoetensack при выделении микоплазм от собак, больных чумой, P. Laidlaw, W. Elford при выделении A. laidlawii из сточных вод. A. Turner и др. для культивирования М. mycoides var. mycoides разработали питательную среду BVF, основа которой состояла из кислого пепсинового перевара мяса и печени крупного рогатого скота. В последующем эта питательная среда в различных модификациях широко использовалась во многих странах мира. Т. Barber, J. Fabricant с успехом выделяли микоплазмы из спермы крупного рогатого скота, используя питательную среду BVF, обогащенную дрожжевым экстрактом и сыворотками лошади или свиньи. По мнению R. Lemcke, питательная среда BVF при ее обогащении дрожжевым экстрактом и сыворотками является хорошей питательной основой для выделения многих видов микоплазм, более требовательных к составу питательных среднем М. mycoides var. mycoides.
В последние 2—3 десятилетия при выделении микоплазм и ахолеплазм широко используются питательные среды, основой которых является бульон из настоя сердечной мышцы крупного рогатого скота с добавленном 1% пептона. D. Edward предложил селективную питательную среду, которая состояла из указанной выше основы, 20% лошадиной сыворотки и 10% свежего дрожжевого экстракта. Дрожжевой экстракт автор готовил по следующей прописи: 50 г пивных дрожжей суспендировал в 200 мл дистиллированной воды и кипятил до прекращения вспенивания, после чего фильтровал через стерилизующие пластинки фильтра Зейтца. Используя эту питательную среду, D. Edward, и W. Fitzgerald с успехом выделяли микоплазмы из дыхательных путей и генитального тракта собак. Несколько позже D. Edward и W. Fitzgerald предложили модифицировать описанную выше питательную среду. При выделении микоплазм из генитального тракта крупного рогатого скота они рекомендовали дополнительно включить в питательную среду ДНК тимуса и муцин свиных желудков. Е. Klieneberger-Nobel, используя в качестве питательной основы бульон из настоя сердечной мышцы крупного рогатого скота, рекомендовала добавлять к ней суспензию эритроцитов (5%) различных видов животных. После кипячения питательную среду осветляли и обогащали 20% лошадиной сыворотки. Автор с успехом использовала эту питательную среду при выделении микоплазм от крыс и мышей. В дальнейшем Е. Klieneberger-Nobel предложила несколько модификаций этой питательной среды. При выделении микоплазм из генитального тракта человека и крупного рогатого скота она рекомендовала добавлять к этой питательной среде натриевую соль нуклеиновой кислоты зобной железы или фильтраты стафилококковых культур в 1%-ной концентрации. В настоящее время питательные, среды, предложенные D. Edward, D. Edward и W. Fitzgerald, Е. Klieneberger-Nobel, в различных модификациях широко используются многими исследователями при выделении микоплазм из различных объектов.
В 1951 г. W. Morton и др., предложили для выделения микоплазм питательную среду, основа которой состояла из обезвоженной вытяжки бычьего сердца и бакто-пептона. В дальнейшем эта питательная среда в обезвоженной форме в виде бакто-PPLO бульона или агара (Difco) получила широкое распространение в Америке и многих других странах. Используя в качестве питательной основы бакто-PPLO агар (Difco) по Мортону, R. Chanock, L. Hayflick и М. Barile предложили для выделения микоплазм питательную среду, которая получила широкую известность под названием среды Хейфлика. Эта питательная среда состояла из 7 частей PPLO агара Difco, 2 частей неинактивированной лошадиной сыворотки и 1 части 25%-ного дрожжевого экстракта, приготовленного последующей прописи: 250 г свежих пекарских дрожжей суспендировали в 1 л дистиллированной воды, подогревали до кипения, фильтровали через фильтровальную бумагу, едким натром доводили pH фильтрата до 8,0 и автоклавировали. Используя эту питательную среду, R. Chanock и др. впервые выделили на плотной питательной среде возбудитель атипичной пневмонии человека и показали, что этот микроорганизм является микоплазмой. Среда Хейфлика получила очень широкое распространение и была использована многими исследователями при выделении и изучении микоплазм от различных видов животных и человека. В последующем эта питательная среда была модифицирована многими исследователями. R. Lemcke, ссылаясь на неопубликованные данные Hers, указывает, что автором были внесены ценные изменения в рецепт приготовления дрожжевого экстракта, которые в значительной степени улучшали качество среды Хейфлика. Он отмечает, что вместо кипячения Hers предложил экстрагировать суспензию дрожжей (1 кг дрожжей на 1000 мл воды) при температуре 80° и pH 4,5 и фильтровать ее через стерилизующие пластинки фильтра Зейтца. Поскольку готовый для использования дрожжевой экстракт имел кислую реакцию, для восстановления pH питательной среды до значения 7,8—8,0 автор рекомендовал добавлять к питательной среде К2НРО4. По данным R. Lemcke, на этой питательной среде М. pneumoniae формировала типичные для микоплазм колонии с хорошо выраженной периферической зоной и характерным, врастающим в агар центром, в то время как на среде Хейфлика колонии этих микроорганизмов были представлены лишь резко гранулированной центральной зоной. Другие виды микоплазм тоже хорошо развивались на питательной среде Хейфлика в модификации Hers. Отмечая, что на жидкой питательной среде М. pneumoniae развивается медленно и максимальное количество колониеобразующих единиц этого микроорганизма обычно не превышает 10в5—10в6, R. Chanock и др. рекомендовали добавлять к жидкой питательной среде Хейфлика 1 % декстрозы. Пo их данным, эта модификация питательной среды способствовала увеличению Скорости роста М. pneumoniae, но не оказывала никакого влияния на титр этих микроорганизмов.
Еще в 1959 г. Е. Klieneberger-Nobel отметила, что хорошей питательной основой при выделении микоплазм является триптический перевар конины. Несколько позже, обобщая результаты собственных исследований, R. Lemcke сообщил, что триптический перевар сердца крупного рогатого скота, по Hartley, является отличной питательной основой и по своим качествам превосходит бульон из настоя сердечной мышцы. В дальнейшем эта питательная основа была широко использована многими исследователями при выделении микоплазм из различных объектов.
В 1965 г. R. Goodwin и др. предложили для выделения микоплазм из респираторного тракта свиней питательную среду, которая состояла из сбалансированного солевого раствора Хенкса (39%), бульона из легочной ткани поросят (30%), инактивированной свиной сыворотки (20%), гидролизата лактальбумина (10%), дрожжевого экстракта (0,5%), пенициллина и ацетата таллия. В последующем R. Goodwin, J. Pryor рекомендовали модифицировать эту среду, заменив в пей бульон из легочной ткани поросят бульоном по Hartley. Триптический перевар сердечной мышцы крупного рогатого скота с успехом использовался в качестве питательной основы И. Курбановым и П. Митрофановым, И. Николаевой и многими другими исследователями при выделении микоплазм из генитального тракта и органов дыхания крупного рогатого скота и свиней.
Первые исследователи, изучавшие респираторный микоплазмоз птиц и инфекционный синусит индеек, широко использовали для выделения микоплазм многие питательные среды, описанные ранее (среда BVF, среда Д. Эдварда и другие). В 1954 г. Н. Adler и др., предложили специально для выделения птичьих микоплазм питательную среду, которая состояла из скошенного бакто-PPLO агара (Difco), содержащего 10% свежей дефибринированной крови лошади и наслоенной жидкой питательной среды, состоящей из бакто-бульона PPLO (Difco), дрожжевого гидролизата (1%) и лошадиной сыворотки. Несколько позже J. Fabricant предложил модифицировать эту питательную среду, заменив в ней лошадиную сыворотку свиной. По мнению автора, эта модификация способствовала более интенсивному развитию М. gallisepticum. В 1956 г. М. Hofstad, L. Doerr предложили для выделения птичьих микоплазм питательную среду, которая содержала бульон из настоя мышечной ткани кур или индеек с 5% крови цыплят и инактивированную сыворотку цыплят или индеек (20%). В дальнейшем эта питательная среда в различных модификациях широко использовалась многими исследователями. В 1966 г. В.В. Киприч предложил для выделения птичьих микоплазм питательную среду, которая состояла из перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 200 мг% (70%), хлористого натрия (0,3%), двуосновного фосфорнокислого натрия (0,5%), пептона, глюкозы (по 0,5%) и инактивированной свиной или лошадиной сыворотки. Несколько позже М.Т. Прокофьева с соавт. и В.И. Бобрышев, изучив в сравнительном аспекте несколько различных модификаций питательных субстратов (триптические и кислотные гидролизаты кормовых дрожжей, пищевого казеина, мясного и рыбного фарша) и стимулирующих добавок (экстракты и автолизаты хлебных, пивных и кормовых дрожжей, экстракты, кислотные и щелочные автолизаты мышечной ткани, сердца, печени и легких крупного рогатого скота), разработали рецептуру и технологию промышленного приготовления концентрированных и сухих питательных сред для культивирования птичьих микоплазм. Удобство применения и результаты испытания, проведенные в условиях пашей лаборатории па 45 штаммах микоплазм 12 различных видов, позволили нам высоко оценить предложенные питательные среды и рекомендовать их промышленное изготовление.
Несмотря на многочисленность питательных сред, рекомендованных для выделения и культивирования микоплазм, до настоящего времени пока не создано универсальной питательной среды, которая могла бы обеспечить удовлетворительное развитие всех известных видов этиx микроорганизмов. Преследуя такие цели, многие исследователи проводили сравнительное изучение и оценку наиболее часто применяемых ингредиентов питательных сред. В 1953 г. Е. Freundt, испытывая питательную среду, которая состояла из отвара плаценты, бактопентона, агара и асцитной жидкости, отмечал, что выбор марки агара и пептона оказывал существенное, а иногда решающее влияние на результаты выращивания микоплазм. Аналогичные выводы сделали ранее Н. Morton и др. при испытании нескольких марок пептонов американского производства. Несколько позже R. Lynn, Н. Morton установили, что отдельные партии агара ингибировали развитие некоторых штаммов микоплазм. Это ингибирующее действие не снималось добавлением крахмала, кипячением среды с 2% эритроцитов или экстрагированием агара эфиром или метанолом.
Еще в 1935 г. Tang и др., испытав влияние сывороток различных видов животных на развитие возбудителя перипневмонии крупного рогатого скота, установили, что сыворотки лошадей, овец и кроликов благоприятно влияли на развитие этих микроорганизмов. В то время как сыворотки морских свинок, крупного рогатого скота были малопригодными для этих целей. Аналогичные выводы сделал D. Edward в отношении сыворотки крупного рогатого скота при изучении 17 штаммов микоплазм различного происхождения. Исследуя микоплазмы, выделенные из генитального тракта человека, W. Kohler тоже сообщает, что сыворотка крупного рогатого скота при 20%-ной концентрации вызывает задержку развития этих микроорганизмов, в то время как лошадиная сыворотка и плазма человека способствовали их росту.
По заключению Н. Morton и др., асцитная жидкость и кроличья сыворотка в 20%-ной концентрации являются наиболее оптимальными добавками для изоляции микоплазм от человека. Остальные испытанные автором сыворотки в концентрации выше 10% в некоторой степени обладали задерживающим действием. По данным Я.Р. Коваленко с соавт., свиная и лошадиная сыворотки в 20%-ной концентрации благоприятно влияют па развитие шести исследованных видов микоплазм, в то время как сыворотка крупного рогатого скота в концентрации 10% и более оказывала ингибирующее действие на некоторые виды этих микроорганизмов.
Оценивая качество сывороточной фракции PPLO (Difco), которая иногда используется вместо сыворотки, Н. Baernstein, J. Quilligan, а несколько позже и многие другие исследователи установили, что эта фракция не заменяет цельной сыворотки и часто не обеспечивает удовлетворительного развития некоторых видов микоплазм. Кроме сыворотки различных видов животных и птицы, многие исследователи рекомендуют использовать в качестве дополнительных факторов роста микоплазм гемоглобин, некоторые аминокислоты, сахара, витамины и т. д.
Большая и интересная работа по сравнительной оценке различных ингредиентов питательных сред была проведена М. Ogata и др. Используя экстракты cердца и мяса различных видов животных, экстракты дрожжей, приготовленные различными методами, пептоны различного происхождения и сыворотки нескольких видов животных, авторы изучили влияние этих компонентов на развитие 24 штаммов микоплазм 17 видов и сделали заключение о том, что наилучшими ингредиентами питательных сред для всех исследованных видов микоплазм являются отвар из сердечной мышцы крупного рогатого скота, лошадиная сыворотка, свежий дрожжевой экстракт и пептон марки BBL.
В нашей стране для выделения и поддержания различных видов микоплазм наибольшее признание и распространение получили питательные треды, основой которых являются триптический перевар сердца крупного рогатого скота и пептон Мартена.
Для приготовления питательной среды на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота используют гидролизат бычьего сердца, мясную воду, дрожжевой экстракт и стерильную неинактивированную сыворотку крови лошади.
В прошлом многие исследователи при первичном выделении микоплазм из различных объектов чаще всего использовали плотные питательные среды. Однако в связи с тем, что в дальнейшем было установлено, что частота выделения микоплазм на жидких и полужидких питательных средах значительно выше, чем на плотных, в настоящее время при первичном выделении микоплазм из различных объектов чаще всего используют жидкие и полужидкие питательные среды. При этом большинство исследователей для подавления бактериальных контаминантов добавляют в питательные среды пенициллин, уксуснокислый таллий, сульфадимезин, полимиксин В, ампициллин и другие антисептики, к которым микоплазмы и ахолеплазмы нечувствительны. Параллельно для выявления бактериальных контаминантов материал высевают на простые питательные среды.
Собственные наблюдения и анализ литературных данных позволяют нам сделать заключение о существенных недостатках описанной схемы первичного выделения микоплазм. Общеизвестно, что пенициллин является универсальным L-трансформирующнм фактором, и под его влиянием многие виды бактерий способны трансформироваться в L-фазы и L-формы даже при кратковременном воздействии. В природе существует большое количество бактериальных видов, которые не развиваются на простых питательных средах и по этой причине не могут быть выявлены. В то же время при посеве материала, контаминированного этими видами, на элективные питательные среды с пенициллином и другими ингибиторами создаются потенциальные возможности L-трансформации этих микроорганизмов. Такое положение часто дезориентирует исследователей и может явиться причиной преждевременной и недостаточно обоснованной идентификации выделенных культур. Показательными в этом отношении являются сообщения R. Wittier и др., P. Smith н др., R. Gentry, К. McKay, R. Truscott, I. Macpherson, W. Russell, В. Левашова и Т. Клушиной, которые длительное время работая с «микоплазмами», выделенными из различных объектов, наблюдали «реверсию» этих культур в бактерии различных видов.
Первые исследователи, изучавшие заболевания, вызываемые микоплазмами, очень часто выделяли эти микроорганизмы из фильтратов патологического материала, для чего широко использовали различные марки бактериальных фильтров. В последующем эта методика очистки материалов от бактериальных контаминантов была необоснованно забыта и заменена менее трудоемким использованием пенициллина и других вышеперечисленных ингибиторов. Однако, учитывая ранее отмеченные недостатки этой методики выделения микоплазм, в нашей лаборатории были проведены сравнительные исследования по выяснению возможности использования различных бактериальных фильтров отечественного производства для очистки патологического материала от бактериальных контаминантов. С этой целью исследовали патологический материал от телят, овец и коз, экспериментально зараженных культурами М. mycoides var. mycoides и М. mycoides var. capri. В результате проведенных исследований было установлено, что фильтрация суспензий патологического материала через мембранные фильтры № 1 и 2 является надежным методом очистки материалов от бактериальных контаминантов при 100%-ной частоте выделения микоплазм. Изложенные материалы собственных исследований и литературные данные позволили нам рекомендовать для первичного выделения микоплазм из патологического материала следующую схему исследований. В соответствии с этой схемой доставленный в лабораторию материал вначале высевают на элективные питательные среды с ингибиторами. Для выявления бактериальных контаминантов его одновременно высевают на элективные питательные среды без ингибиторов, простые и сывороточные МПБ и МПА, среду Китта-Тароцци. Затем из материала готовят 20%-ную суспензию, которую центрифугируют при 1000—2000 об/мин, и надосадочную жидкость фильтруют через мембранные фильтры № 1 и 2 при вакууме 500—600 мм ртутного столба. Фильтраты высевают на жидкие, полужидкие и твердые элективные питательные среды без ингибиторов и для контроля качества фильтрации па МПА и МПБ.
По нашему мнению, описанная схема первичного выделения микоплазм позволяет исследователям более четко дифференцировать выделенные микроорганизмы, значительно уменьшая возможность ошибок при их идентификации.
Посевы обычно инкубируют при 37° в течение 7 дней ежедневно подвергая просмотру. Плотные питательные среды исследуют под микроскопом, обращая особое внимание па колонии, морфологически сходные с колониями микоплазм. При обнаружении таких колоний их вместе с агаровым блоком отсевают на жидкую или полужидкую питательную среду без ингибиторов. При отсутствии видимого роста на аналогичных питательных средах проводят не менее пяти последовательных пассажей с 5-дневными интервалами. Если в течение и этого времени рост па питательных средах не будет обнаружен, материал считается свободным от микоплазм и ахолеплазм.
Некоторые исследователи пытались использовать для первичного выделения микоплазм куриные эмбрионы и клеточные культуры. Однако многочисленные сообщения о спонтанной контаминации микоплазмами куриных эмбрионов и клеточных культур значительно снижают целесообразность применения этих методов при выделении микоплазм и ахолеплазм. Более того, эти методы не позволяют выяснить целый ряд морфологических и физиологических признаков выделенных микроорганизмов, которые являются характерными для микоплазм и ахолеплазм и могут быть изучены только на бесклеточных питательных средах.
В соответствии с данными D. Ford, D. Ford, P. MacDonald, С. Livingston и многих других исследователей при первичном выделении Т-штаммов микоплазм обычно используют питательные среды с кислым значением pH и без ацетата таллия, к которому эти микроорганизмы более чувствительны, чем классические микоплазмы. Учитывая, что Т-штаммы микоплазм достигают максимального титра уже через 16—18 часов инкубации, серийные пассажи при выделении этих микроорганизмов необходимо проводить через каждые 20—24 часа.
Учитывая многочисленные сообщения о частых случаях выделения смешанных культур, выделенные микроорганизмы вначале подвергают трех-пятикратному клонированию, после чего приступают к изучению их свойств и идентификации.
Для детального изучения морфологии колоний готовят их отпечатки па стеклах по методикам, рекомендованным L. Dienes и Е. Клипебергер-Нобель.
В практических условиях нередко используют и второй метод.
Структурные элементы микоплазм и ахолеплазм окрашиваются краской Романовского—Гимза в светлофиолетовый цвет. Все виды микоплазм грамотрицательны. Кроме этого, при изучении морфологии микроструктурных элементов микоплазм и ахолеплазм нередко используют фазово-контрастный метод исследования и электронную микроскопию.
Убедившись, что по характеру роста на элективных питательных средах, по морфологии колоний и микроструктурных элементов выделенные микроорганизмы могут быть отнесены к отряду Mycoplasmatales, приступают к идентификации семейства этих микроорганизмов. В настоящее время для этих целей предложено большое количество разнообразных несерологических тестов. В первую очередь необходимо выяснить потребность выделенных микроорганизмов в стероле и их способность развиваться при комнатной температуре (22°). В качестве дополнительных дифференциальных тестов можно использовать резистентность ахолеплазм к дигитанину и чувствительность этих микроорганизмов к ацетату таллия. В 1971 г. М. Kunze, изучая чувствительность 34 штаммов микоплазм и ахолеплазм 11 видов к натрий-полианетол-сульфонату, установил, что этот синтетический антикоагулянт угнетает развитие микоплазм и не оказывает ингибирующего действия на ахолеплазмы. По мнению многих авторов, этот тест тоже может быть использован для дифференциации микоплазм и ахолеплазм.
Методика выполнения этого теста заключается в следующем: бульонные культуры выделенных микроорганизмов высевают на пластинчатые питательные среды, после чего на поверхность среды накладывают диски фильтровальной бумаги, смоченные 5%-ным раствором натрий-полианетол-сульфоната. Реакцию учитывают в процессе инкубации и оценивают по наличию или отсутствию роста вокруг дисков.
Длительное время считали, что отличительным признаком ахолеплазм является способность этих микроорганизмов синтезировать каратиноиды. Однако в связи с тем, что в последние годы семейство ахолеплазм пополнилось новым видом — A. axanthum, который не образует никаких пигментов, этот признак уже нельзя считать дифференциальным для ахолеплазм.
В дальнейшем для предварительной видовой дифференциации выделенных микроорганизмов изучают способность этих культур диссимилировать углеводы, вызывать гемолиз эритроцитов, восстанавливать метиленовую синь, соли тетразолия и т. д.
Гемолитическая активность и характер гемолиза изучают на плотных пластинчатых питательных средах, к которым добавляют 3—5% суспензии эритроцитов различных видов животных.
При изучении способности выделенных культур ферментировать углеводы используют жидкие и полужидкие питательные среды с фенолротом (0,002%) и различными углеводами (0,5—1%). Реакцию учитывают в течение 5—7 дней инкубации и оценивают по изменению окраски среды от слабо-фиолетового до оранжевого и желтого цвета.
Для изучения способности выделенных культур восстанавливать метиленовую синь готовят 0,2%-иый раствор краски и добавляют его к жидкой среде в конечной концентрации 1:50000. Среду с синькой разливают по 2,0 мл в пробирки и засевают 72-часовой бульонной культурой изучаемых микроорганизмов. Реакцию учитывают в процессе инкубации. При обесцвечивании среды реакция оценивается положительно.
Способность выделенных культур восстанавливать голи тетразолия изучают па жидких, полужидких и плотных питательных средах, к которым добавляют 0,025—0,005% 2,3,5-трифенилхлористого тетразолия. Реакцию учитывают в течение 5—7 дней инкубации и оценивают положительно при изменении окраски среды.
Т-штаммы микоплазм дифференцируют от классических микроорганизмов этого семейства по величине колоний, скорости роста и уреазной активности. В 1967 г. М. Shepard, С. Lunceford, изучая Т-штаммы микоплазм, впервые обнаружили, что эти микроорганизмы в отличие от классических микоплазм обладают уреазной активностью. Используя питательные среды с фенолротом (0,001%) и различными концентрациями мочевины, авторы установили, что наивысшая уреазная активность Т-микоплазм наблюдается при 0,5%-ной концентрации мочевины в питательной среде с pH 6,0±0,5. Более высокая концентрация мочевины (выше 1%) ингибирует развитие этих микроорганизмов. По данным авторов, реакцию учитывают в течение 24 часов инкубации посевов и оценивают положительно по изменению цвета среды от желтого до оранжевого и красного.
Окончательная идентификация выделенных культур проводится серологическими методами.
