Чувствительность микоплазм к различным физическим и химическим воздействиям

24.06.2015

Вопросы влияния различных физических и химических факторов на биологию микоплазм и ахолеплазм изучены недостаточно. Тем не менее имеющиеся литературные данные позволяют характеризовать основные моменты взаимодействия этих микроорганизмов с внешней средой.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что чувствительность микоплазм и ахолеплазм к различным физическим и химическим воздействиям характеризуется большой гетерогенностью, которая зависит от видовой принадлежности этих микроорганизмов, их происхождения, среды обитания, фазы роста и некоторых других факторов.
Температура. Микоплазмы и ахолеплазмы способны развиваться на питательных средах в широком диапазоне температурных режимов. J. Al-Aubaidi, J. Fabricant при изучении свойств 128 культур микоплазм различных видов и серогрупп, выделенных от крупного рогатого скота, установили, что некоторые исследованные культуры, в том числе и М. mycoides var. mycoides, удовлетворительно развивались только при 37°, в то время как другие росли при 25 или 42°. Отдельные культуры, в том числе и М. bovirhinis, развивались при всех трех указанных выше температурных режимах. А.С. Серебряков с соавт. сообщают, что из 20 исследованных культур М. gallisepticum 2 штамма развивались на питательных средах при температуре от 18 до 40°, 10 штаммов росли при 32—40°. Рост остальных 8 культур авторы наблюдали только при температуре 38—40°.
T-штаммы микоплазм, выделенные из мочеполового тракта людей, развиваются на питательных средах при температуре от 30 до 36°, a A. laidlawii — при 22—37°.
Для подавляющего большинства патогенных видов микоплазм человека и животных оптимум температуры культивирования соответствует 37°, для птичьих штаммов — 38°, T-штаммов — 36°, для A. laidlawii — 30°.
Микоплазмы и ахолеплазмы характеризуются высокой устойчивостью к действию низких температур. По мере повышения температуры окружающей среды их устойчивость снижается. По данным Ё. Клинебергер-Нобель, при минус 20° и ниже бульонные культуры микоплазм сохраняют жизнеспособность от 6 до 12 месяцев, а при 4° не более 2 недель. Н. Kelton, изучив сохраняемость 26 штаммов микоплазм различного происхождения, указывает, что при минус 65° все исследованные бульонные культуры оставались жизнеспособными в течение 12 месяцев (срок наблюдения), а при минус 26° — не более 10 месяцев. Хранение этих культур при температуре 5° в большинстве случаев сопровождалось потерей их жизнеспособности. По данным D. Ford, T-штаммы микоплазм при минус 20° остаются жизнеспособными до 90 дней, а при 4° не более 16 суток.
Характеризуя устойчивость М. gallisepticum к минусовым температурам, М. Biester и L. Schwarte указывают, что при -30° микоплазмы этого вида сохраняют жизнеспособность до 5 лет, а при -25° до 3 лет. В то время как в условиях рефрижератора (2—4°) бульонные культуры М. gallisepticum остаются жизнеспособными до 30—40, в редких случаях до 100 дней.
Устойчивость микоплазм к различным температурным режимам зависит от их видовой принадлежности. При температуре 4° большинство исследованных культур (М. mycoides var. mycoides, М. mycoides var. capri, M. gallisepticum и др.) оставались жизнеспособными в течение 30—90 дней, в то время как другие (М. agalaсtiae, М. iners) сохраняли жизнеспособность более длительное время. При комнатной температуре (20—22°) на жидких питательных средах большинство исследованных видов микоплазм сельскохозяйственных животных, в том числе птицы, сохраняют жизнеспособность 15—90 дней, а в условиях термостата (37°)—15—75 дней. На плотных питательных средах при этих температурных режимах микоплазмы сохраняются менее продолжительное время.
Микоплазмы обладают высокой чувствительностью к температуре выше 40°. Проведя исследования 31 бульонной культуры микоплазм 11 видов и серогрупп, Я.Р. Коваленко с соавт. сообщают, что пятиминутная экспозиция при 50° вызывала гибель 4 культур, а десятиминутная — 14 культур. При воздействии температуры 60° в течение 5 минут способность к репродукции сохраняли только 7 культур. Десятиминутная экспозиция при 60° вызывала гибель всех исследовавшихся штаммов. Аналогичные результаты были получены при воздействии температуры 70° в течение 30 секунд.
А.С. Серебряков с соавт. сообщают, что при температуре 45° М. gallisepticum погибает в течение 1 часа, а при 50° — через 20 минут. По данным А.Ф. Бакая, бульонные культуры птичьих штаммов микоплазм при 45° погибают в течение 120—160 минут, при 55° в течение 40—50 минут, а при 65° за 10—15 минут.
Описывая влияние температурных факторов на выживаемость микоплазм и ахолеплазм, многие исследователи подчеркивают, что термостабильность этих микроорганизмов зависит от окружающей их среды. P. Smith, S. Sasaki установили, что при температуре 37° микоплазмы выживают в дистиллированной воде 60 минут, в физиологическом растворе 120 минут, в растворе Рингера 60 минут, в М/15 фосфатном буфере при pH 7,0 — 90 минут, а при pH 5,6 только 30 минут. В надосадочной жидкости свежей питательной среды эти микроорганизмы сохраняли жизнеспособность более 24 часов. При комнатной температуре максимальный срок выживаемости микоплазм, суспендированных в физиологическом растворе и фосфатном буфере (pH 7,0), не превышал 6 часов. По данным М. Butler, В. Knight, М. bovigenitalium погибает при комнатной температуре в течение 4 часов в дистиллированной воде, физиологическом растворе и фосфатном растворе Кребс—Рингера. Микоплазмы, выделенные от птиц, сохраняют жизнеспособность в дистиллированной и водопроводной воде не более 24—48 часов. Интересные в этом отношении исследования были проведены К. Kim и др. Бульонные культуры 5 видов микоплазм, выделенных от человека (М. salivarium, М. fermentans, М. hominis I, М. pneumoniae, М. pharyngis), в логарифмической фазе роста центрифугировали при 30 000 g в течение 30 минут, отмывали и ресуспендировали в физиологическом растворе, pH 7,0, до первоначального объема культуры. Полученную суспензию хранили при различных температурных режимах (4, 37, 56°) и исследовали на выживаемость. Было установлено, что при 56° все исследованные культуры очень быстро теряли жизнеспособность. Уже через 32 секунды выживаемость исследованных микроорганизмов составляла только 50%. Для большинства исследованных культур при 37° этот показатель не превышал 22 минут. Исключение составляла М. pneumoniae, у которой в течение 5 часов жизнеспособность сохранялась на 50%. Видовые различия термостабильности исследованных видов микоплазм особенно четко были заметны при 4°. В этом температурном режиме М. pharyngis инактивировалась очень быстро, в то время как М. pneumoniae в течение 37 часов сохраняла жизнеспособность на 50%. Для остальных трех видов этот показатель равнялся 1,3—3,4 часа. Авторы полагают, что низкая термостабильность М. pharyngis связана с меньшей устойчивостью нитевидных форм структурных элементов, которые преобладают у этого вида микоплазм в логарифмической фазе роста.
Подчеркивая зависимость термостабильности микоплазм от окружающей среды, P. Smith указывает, что время выживания микоплазм может быть значительно увеличено при использовании в качестве суспендирующей жидкости 50%-ного раствора глицерина на питательной среде или физрастворе. Одновременно он отмечает, что снижение pH суспендирующей жидкости ниже 7,0 отрицательно влияет на термостабильность микоплазм.
Чередующиеся циклы замораживания и оттаивания. P. Smith, S. Sasaki и другие исследователи сообщают, что при суспендировании микоплазм в дистиллированной воде чередующиеся циклы замораживания и оттаивания вызывают быстрый лизис этих микроорганизмов. Суспендирование микоплазм в физиологическом растворе, питательной среде, в растворах сахарозы значительно повышает их устойчивость. По мнению P. Smith, поддерживающая питательная среда может предупреждать кристаллизацию льда внутриклеточных структур и таким образом снижать разрушающее действие последовательного замораживания и оттаивания на микоплазмы.
К. Kim и др. сообщают, что бульонные культуры 5 видов микоплазм человека оставались жизнеспособными даже после 20 циклов замораживания и оттаивания. При этом степень инактивации была приблизительно одинаковой. В зависимости от первоначального подсчета колоний после 20 циклов во всех исследованных пробах оставалось до 10в5—10в6 колониеобразующих единиц на 1 мл культуры.
Я.Р. Коваленко с соавт. установили, что устойчивость микоплазм к многократному замораживанию и оттаиванию зависит от видовой принадлежности этих микроорганизмов. Бульонные культуры М. gallinarum и М. iners сохраняют жизнеспособность до 26 циклов, в то время как М. agalactiae погибает после 15-кратного замораживания и оттаивания, а М. mycoides var. mycoides и М. mycoides var. capri — после 10 циклов. После 5—6 циклов в культурах резко снижалось количество колониеобразующих единиц, а на сывороточном агаре формировалось большое количество уродливых нетипичных для микоплазм колоний.
Лиофилизация. Многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей свидетельствуют о том, что все известные виды микоплазм и ахолеплазм, в том числе и Т-штаммы, выдерживают лиофильное высушивание и длительное время сохраняют жизнеспособность в лиофилизированном состоянии.
Изучая устойчивость микоплазм различных видов к некоторым физическим факторам, Я.Р. Коваленко с соавт. установили, что сам процесс лиофильного высушивания вызывает гибель значительного количества клеточных единиц, в то время как хранение лиофилизированных культур в течение 120 суток при температуре 4° практически не оказывало влияния на жизнеспособность этих микроорганизмов. Делая аналогичные выводы, P. Smith указывает, что в процессе лиофилизации происходит снижение количества жизнеспособных единиц на 1—4 log. При этом он подчеркивает, что выживаемость микоплазм различных видов зависит в основном от состава суспендирующей среды, При лиофилизации микоплазм, суспендированных в дистиллированной воде, наблюдается 100%-ная гибель этих микроорганизмов. Наименьшее снижение жизнеспособности отмечается при лиофилизации микоплазм в питательной среде с высоким содержанием протеина. По мнению автора, наилучшим защитным ингредиентом при лиофилизации микоплазм является смесь равных объемов обезжиренного молока и инактивированной лошадиной сыворотки. Неплохие результаты были получены Г.А. Грошевой при использовании в качестве суспендирующей среды для лиофилизации птичьих микоплазм молочно-лактозо-сахарозной среды, состоящей из обезжиренного молока, 5% сахарозы и 5% лактозы, В сахарозо-желатино-агаровой среды, в состав которой входил 10%-ный раствор сахарозы, 1—1,5% желатины и 0,2% агар-агара.
Наиболее часто в качестве защитного ингредиента при лиофилизации микоплазм различных видов используется стерильная сыворотка крови лошади, которая добавляется к бульонным культурам до 50%-ной концентрации. По мнению Th. Hubrig, D. Schimmel, добавление предохранительных коллоидов при лиофилизации микоплазм вообще не является необходимостью в связи с тем, что обычно применяемые для культивирования этих микроорганизмов питательные среды содержат высокий процент сыворотки.
Анализ литературных данных и собственные наблюдения свидетельствуют о том, что различные виды микоплазм, сохраняясь длительное время в лиофилизиро-ванном состоянии, очень долго не утрачивают многие исходные биологические свойства. Г.А. Грошева сообщает, что лиофилизированные культуры М. gallisepticum в условиях рефрижератора сохраняли жизнеспособность b свойственные им антигенные признаки до 7 лет. Отдельные культуры, хранившиеся в лиофилизированном состоянии в течение 2—5 лет, вызывали заболевание у экспериментально зараженных цыплят. И. Куюмджиев тоже отмечает, что лиофилизированные культуры М. agalactiae сохраняют жизнеспособность до 3 лет, а вирулентность — свыше 750 суток.
По нашим наблюдениям, лиофилизированные культуры М. mycoides var. mycoides, М. mycoides var. capri, М. gallisepticum, М. agalactiae, М. iners и М. gallinarum сохраняют жизнеспособность свыше 5 лет (срок наблюдения). При экспериментальном заражении телят культурой М. mycoides var. mycoides (штамм 1970) спустя 41 месяц после лиофильного высушивания нам удалось воспроизвести у животных тяжело протекавшее заболевание, которое сопровождалось гипертермией, резко выраженным истощением, поражением суставов и другими признаками.
Аэрозольное состояние. В связи с тем, что многие виды микоплазм являются возбудителями респираторных заболеваний, при которых аэрогенная передача инфекционного начала, по-видимому, играет ведущее значение, возникла необходимость изучить выживаемость этих микроорганизмов в аэрозольном состоянии. Первые исследования в этом направлении показали, что уровень относительной влажности окружающей среды является определяющим условием выживаемости микоплазм и ахолеплазм в аэрозолях.
D. Wright и др., исследуя культуры A. laidlawii и М. gallisepticum, взятые в опыт в стационарной фазе роста, установили, что в течение 5 часов при температуре 27° наивысшая выживаемость A. laidlawii регистрируется при относительной влажности от 25% и ниже и при 75% и выше. Повышение относительной влажности выше 25% и ее снижение ниже 75% прогрессивно снижало выживаемость этих микроорганизмов. Наименьшую выживаемость A. laidiawii в аэрозольном состоянии авторы наблюдали при относительной влажности 10%. М. gallisepticum по сравнению с A. laidlawii обладала меньшей резистентностью в аэрозольном состоянии. Оптимальную выживаемость микроорганизмов этого вида авторы наблюдали только при относительной влажности 10%. При температуре 27° и относительной влажности 25% и более в течение 5 часов 90% микроорганизмов этого вида теряло жизнеспособность. При относительной влажности 50—60% М. gallisepticum полностью погибали.
Несколько иные данные о выживаемости птичьих микоплазм в аэрозольном состоянии получены другими исследователями. А.А. Закомырдин отмечает, что культуры М. gallisepticum при температуре 20—21° и относительной влажности 76—80% сохраняют свои биологические свойства в аэрозолях не менее 20 минут. По данным С. Beard и D. Anderson, М. gallisepticum и М. meleagridis в аэрозольном состоянии остаются жизнеспособными в течение 6 часов. Характеризуя резистентность М. pneumoniae в аэрозолях, D. Wrigth и др. отмечают, что при температуре 27° наименьшая летальность микроорганизмов этого вида наблюдается при очень высоком и очень низком значениях относительной влажности, а наибольшая при 60 и 80%. Дальнейшие исследования D. Wright и др. показали, что при всех режимах относительной влажности повышение температуры окружающей среды сокращало время выживания микоплазм в аэрозолях.
Исследуя несколько видов микоплазм человека, R. Kundsin установил, что ультрафиолетовые лучи при различных значениях относительной влажности тоже существенно снижают выживаемость этих микроорганизмов в аэрозолях. Обобщая литературные данные по этому вопросу, P. Smith указывает, что резистентность микоплазм и ахолеплазм в аэрозольном состоянии зависит от взаимодействия многих факторов, среди которых наряду с уровнем относительной влажности и температурой окружающей среды необходимо учитывать возраст микроорганизмов, способ распыления культур, размер аэрозольных частиц, состав суспендирующей среды и т. д.
Концентрация водородных ионов. Подавляющее большинство известных видов микоплазм и ахолеплазм способно развиваться на питательных средах в широком диапазоне концентрации водородных ионов. Исследования, проведенные D. Edward, показали, что эти микроорганизмы могут расти на питательных средах при pH 6,8—9,2. Указывая на видовую чувствительность микоплазм к различным значениям pH, М. Shepard, С. Lunceford сообщают, что для М. hominis и М. saliwarium диапазон pH может быть еще более широким (от 5,0 до 10,0). При этом они отмечают, что рост этих микроорганизмов значительно ухудшается при крайних значениях pH. Изучая чувствительность 128 культур микоплазм и ахолеплазм, выделенных от крупного рогатого скота, к высоким и низким значениям pH, J. Al-Aubaidi, J. Fabricant установили, что некоторые виды и серогруппы (в их числе М. bovirhinis) удовлетворительно развивались при pH 5,5 и 9,5. Культуры М. mycoides var. mycoides и A. laidlawii оказались чувствительными к низким концентрациям водородных ионов, а культуры М. bovimastitidis — к высоким. Особую группу составляли культуры М. bovigenitalium, которые вообще не росли при указанных выше значениях pH. При исследовании М. mycoides var. mycoides, М. mycoides var. capri, M. agalactiae, M. gallisepticum, M. gallinarum и M. iners Я.P. Коваленко с соавт. установили, что на жидких питательных средах при значениях pH ниже 7,5 или выше 8,5 выход бактериальной массы значительно снижается, а на плотных питательных средах все исследованные культуры микоплазм, за исключением М. gallisepticum, формировали шероховатые колонии с мелкозернистой гранулярной поверхностью. Отдельные колонии не имели четкой формы и структуры.
Для подавляющего большинства известных видов микоплазм животных и человека оптимальные значения pH варьируют в пределах 7,5—8,0. Отдельные виды лучше культивируются при иных значениях pH. Для М. hominis и М. saliwarium оптимум концентрации водородных ионов составляет 6,0—7,0, для М. pharyngis — 7,0 и М. pneumoniae — 6,0— 8,0.
Виды микоплазм, использующие в качестве источника энергии углеводы, в процессе культивирования образуют большое количество кислоты, которая отрицательно влияет на жизнеспособность и некоторые другие свойства этих микроорганизмов. P. Smith, ссылаясь на свои работы, проведенные совместно с W. Koostra, сообщает, что снижение pH при культивировании A. laidlawii и М. arthritidis сопровождается количественными изменениями липидного состава этих микроорганизмов.
Образование кислоты в процессе культивирования М. pneumoniae оказывает влияние на иммуногенные свойства микоплазм этого вида. Они теряют способность действовать в качестве антигена в реакции иммунодиффузии и не способны вызывать образование антител, ингибирующих редукцию тетразолия. В связи с изложенным при культивировании сбраживающих видов микоплазм возникает необходимость стабилизации pH питательных сред буферными системами. Чаще всего для этих целей используют фосфаты. Следует, однако, отметить, что количество буфера, которое добавляется к питательным средам, ограничивается осмотическими потребностями этих микроорганизмов.
Изучая A. laidlawii, М. Tourtellotte и др. установили, что высокие концентрации фосфата токсичны для микроорганизмов этого вида. В связи с изложенным авторы заменили фосфатный буфер трис-буфером-(2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3 пропанедиол). По данным D. Pollak и др., N-трис-(гидроксиметил)-2-амино-этансульфоновая кислота и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота наиболее эффективны в качестве буфера при культивировании М. pneumoniae. И наоборот, трис-(гидроксиметил)-аминометан, триэтаполамин и 3,6-эндометилен-1,2,3,6-тетрагидрофталиковая кислота угнетали рост этого вида микоплазм.
В отличие от классических микоплазм так называемые T-штаммы очень чувствительны к щелочному значению pH. Эти микроорганизмы культивируются на питательных средах при pH от 5,0 до 8,0. Концентрация водородных ионов свыше 8,0 резко угнетает их развитие. Оптимальный уровень pH для этих микроорганизмов ранен 6,0±0,5. Это наглядно показали М. Shepard, С. Lunceford, которые, исследуя интенсивность роста T-штаммов микоплазм при pH 5,0; 6,0; 7,0 и 8,0, установили, что максимальное количество колониеобразующих единиц в 1 мл культуры составляло при указанных значениях pH соответственно 1,7*10в5 5,9*10в7 1,3*10в6 и 9,5*10в3. Дальнейшими работами М. Shepard, С. Lunceford, D. Ford, J. MacDonald было установлено, что Т-штаммы микоплазм, обладая уреазной активностью и используя в процессе своего развития в качестве источника энергии мочевину, образуют аммоний, который вызывает защелачивание питательной среды, резко угнетающее жизнеспособность этих микроорганизмов. В связи с изложенным при выделении и культивировании Т-штаммов микоплазм возникает необходимость предотвращения избыточного увеличения концентрации водородных ионов. Это достигается стабилизацией pH различными буферами. По данным R. Manchee, D. Taylor-Robinson, наилучшие результаты могут быть получены при использовании в качестве буфера 0,05 M М-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES). Включение этого буфера в питательные среды увеличивает жизнеспособность T-штаммов микоплазм и стимулирует развитие на агаре более крупных колоний, что является немаловажным при изучении этих микроорганизмов.
Осмотическое давление. Отсутствие ригидной клеточной стенки, пластичность и полиморфизм микоплазм и ахолеплазм позволяли в прошлом некоторым исследователям высказывать предположения о высокой чувствительности этих микроорганизмов к осмотическому окружению. Однако дальнейшими исследованиями эта точка зрения была подвергнута сомнению.
Еще в 1956 г. A. Rodwell, изучая роль сыворотки в питании М. mycoides var. mycoides, отметил, что тоничность использованной питательной среды была критической для этого микроорганизма. В дальнейшем он установил, что оптимальный рост этого вида микоплазм наблюдается на питательных средах при осмотическом давлении в 12 атм.
Большую работу в этом направлении провел несколько позже R. Leach. Исследуя на жидких и плотных питательных средах осмотические потребности микоплазм и ахолеплазм 7 видов, автор установил, что осмотическое давление среды в 10 атм. является оптимальным для этих микроорганизмов. Он обнаружил, что некоторые виды микоплазм, например М. gallisepticum, способны развиваться на питательных средах в небольшом диапазоне тоничности (6,8—14 атм.), в то время как A. laidlawii росла при осмотическом давлении от 2,7 до 27 атм. По его данным, М. mycoides var. capri и M, gallinarum размножаются при осмотическом давлении в 2,7 атм., однако их рост прекращается при повышении тоничности свыше 14 атм.
По чувствительности к осмотическому давлению питательных сред музейные культуры микоплазм существенно не отличаются от свежевыделенных штаммов этих микроорганизмов. Культивирование большинства исследованных видов микоплазм в питательных средах с субоптимальным осмотическим давлением сопровождалось только незначительным снижением скорости роста, в то время как при крайних значениях тоничности, кроме резкого снижения скорости и интенсивности роста в отдельных случаях, отмечали удлинение логарифмической фазы роста. Автором были получены аналогичные результаты при использовании для поддержания тоyичности питательных сред различных неорганических солей (NaCl, KCl, Na2SO4), сахарозы и сбалансированного солевого раствора (NaCl: KCl: Na2SO4: MgCl2 в молярном соотношении 5:3:1:1). Обобщая результаты этих исследований, R. Leach отмечает, что микоплазмы и ахолеплазмы могут развиваться в более ограниченном диапазоне тоничности питательных сред, чем бактерии, и слабо адаптируются к гипотоническим и гипертоническим условиям. Подчеркивая, что стериннезависимая A. laidlawii является наименее требовательной в отношении осмотического давления, он указывает, что осмотические потребности микроорганизмов этого вида не изменяются при культивировании на питательных средах с сывороткой и без нее. В то время как при культивировании микоплазм наблюдается четкая взаимосвязь между концентрацией сыворотки в питательной среде и потребностью в тоничности. Высокая концентрация сыворотки благоприятно влияет на рост этих микроорганизмов в питательных средах с низкой тоничностью, и, наоборот, гипертонические условия были необходимы для оптимального развития при низких концентрациях сыворотки. Эти наблюдения позволили автору высказать предположение о том, что сыворотка, добавляемая в питательные среды, наряду с другими функциями, выполняет роль фактора, предохраняющего микоплазмы от вредных осмотических условий.
Как показали P. Smith, S. Sasaki, а позже подтвердили R. Leach, S. Razin, М. Argaman, К. Kim и др. и другие исследователи, микоплазмы и ахолеплазмы относительно резистентны к осмотическому шоку. Сразу после переноса этих микроорганизмов из изотонических условий в гипертоническую или гипотоническую среду или из гипотонической в гипертоническую и наоборот заметного снижения жизнеспособности не происходит. По мнению P. Smith, это объясняется небольшими размерами микоплазм и ахолеплазм и их пластичностью.
Уже первые исследования в этом направлении показали, что устойчивость микоплазм и ахолеплазм к осмотическому шоку имеет прямую зависимость от температуры окружающей среды. P. Smith, S. Sasaki, К. Kim и др. установили, что продолжительное содержание микоплазм в гипотонической среде при 37° вызывает быструю гибель этих микроорганизмов. Изучая влияние температуры на осмотический лизис A. laidlawii, S. Razin установил, что в течение 30 минут при 0° в гипотонических условиях жизнеспособность этих микроорганизмов почти не изменялась. При 18° количество жизнеспособных единиц через 30 минут сокращалось на 2 log, а при 37° на 4 log. Аналогичная зависимость осмотического лизиса от температуры и времени инкубации была установлена автором у М. mycoides var. capri и М. neurolyticum. В противоположность микоплазмам и ахолеплазмам протопласты Micrococcus lysodeikticus лизировались в гипотоническом растворе NaCl даже при 0° почти мгновенно. Зависимостью осмотического лизиса микоплазм от температуры, по-видимому, можно объяснить и наблюдения М. Butler, В. Knigth, которые отмечали, что микоплазмы быстро погибали при отмывании в 0,01 M фосфатном буфере комнатной температуры (около 20°), но оставались жизнеспособными при температуре 2—4°. По мнению P. Smith, подобное влияние низких температур на осмотический лизис микоплазм и ахолеплазм в гипотонических условиях может быть обусловлено способностью оболочки этих микроорганизмов поддерживаться в форме геля при низкой температуре.
В процессе изучения влияния осмотического шока P. Smith, S. Sasaki установили, что микоплазмы, суспендированные в растворах сахарозы высокой молярности, даже при 37° остаются жизнеспособными в течение 6 часов. По мере снижения молярности суспендирующих растворов сахарозы время выживаемости микоплазм при этой температуре резко сокращалось.
В связи с тем, что вязкие растворы желатины и желудочного муцина не повышали времени выживаемости микоплазм, авторы считают, что защитное действие растворов сахарозы высокой молярности не было обусловлено вязкостью этих растворов. Они полагают, что чрезвычайно гипертонические растворы сахарозы могут выбывать обезвоживание этих микроорганизмов и тем самым снижать интенсивность их обмена веществ. Кроме того, по их мнению, сахароза предотвращает угнетающее действие возможных токсических продуктов обмена, анионов и катионов. Поскольку добавление аденозинтрифосфата, глутамина или липопротеинового фактора роста не влияло на время выживаемости микоплазм, авторы делают заключение о том, что защитные действия высокомолярных растворов сахарозы не связаны с их высоким энергетическим потенциалом.
Делая аналогичные выводы о влиянии гипертонических растворов сахарозы на выживаемость микоплазм, К. Kim и др. указывают на существование видовой чувствительности этих микроорганизмов к осмотическому лизису. Они сообщают, что М. fermentans плохо сохранялась даже в 5 M растворе сахарозы, в то время как выживаемость М. pharyngis была высокой и в 1 М, и в 5 M растворах. Интересные в этом отношении исследования были проведены S. Razin, который установил, что многие виды микоплазм по осмотической хрупкости очень неоднородны. Однако в целом эти микроорганизмы обладали значительно большей резистентностью к осмотическому шоку, чем A. laidlawii. По мнению D. Spears, P. Provost, различная осмотическая стабильность микоплазм и ахолеплазм, по-видимому, определяется неодинаковой степенью ригидности клеточных мембран и большей их проницаемостью у последних.
Чувствительность микоплазм и ахолеплазм к осмотическому лизису зависит от возраста культур. В логарифмической фазе роста эти микроорганизмы проявляли меньшую резистентность к осмотическим воздействиям. При кислом и щелочном значении pH суспендирующей среды их осмотическая хрупкость тоже увеличивалась. По его данным, приблизительно нейтральное значение pH является оптимальным. Нагревание суспензии этих микроорганизмов до 55 или 65° заметно уменьшало действие осмотического шока.
Существование четких различий в осмотической стабильности микоплазм и A. laidlawii позволили предполагать, что определенные компоненты питательных сред могут оказывать влияние на осмотическую хрупкость этих микроорганизмов. Эти предположения были подтверждены дальнейшими исследованиями S. Razin и др. Используя различные добавки при культивировании A. laidlawii на триптозной питательной среде, авторы установили, что холестерол не оказывает значительного влияния на осмотическую стабильность этих микроорганизмов. Ненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью (олеиновая, линолевая, линоленовая и арахидонозая) улучшали рост A. laidlawii и увеличивали их резистентность к осмотическому лизису. Наоборот, насыщенные жирные кислоты (пальмитиновая и стеариновая) не влияли па осмотическую стабильность A. laidlawii и в концентрации 50 мг/мл ингибировали их рост. Добавление к питательным средам глюкозы существенно улучшало рост A. laidlawii, однако при этом чувствительность клеток к осмотическому лизису повышалась. Эти данные позволили авторам сделать заключение о том, что липидный состав клеточных мембран, зависимый от липидного состава питательных сред, влияет на осмотическую стабильность микроорганизмов.
Дивалентные и поливалентные катионы, спермин и спермидин в концентрации 10в-5M и даже ниже тоже защищают микоплазмы и ахолеплазмы от осмотического лизиса. По мнению P. Smith, эти катионы способствуют конденсации клеточных мембран.
Обобщая литературные данные, характеризующие осмотическую стабильность микоплазм и ахолеплазм, W. Clyde указывает, что потеря репродуктивной способности и лизис этих микроорганизмов в гипотонических условиях, по-видимому, могут быть обусловлены повреждениями целостности клеточных мембран, вызванными косвенными факторами, а не прямым физическим разрушением клетки.
Действие ультразвука. Исследованиями P. Smith, S. Sasaki и К. Kim и др. было установлено, что микоплазмы очень чувствительны к ультразвуковой дезинтеграции. Авторы установили, что 30 минутная обработка микоплазм при частоте 9 кгц и температуре 4° инактивировала 99% всех исследованных культур.
Они обнаружили, что состав суспендирующей среды не оказывал заметного влияния на выживаемость этих микроорганизмов. Результаты были аналогичными при суспендировании микоплазм в дистиллированной воде, в М/15 фосфатном буфере (pH 7,0), в М/15 трис-(гидроксиметил)-аминометановом буфере (pH 7,5) и в сывороточной фракции PPLO Дифко. Чувствительность различных видов микоплазм к ультразвуковой дезинтеграции была неодинаковой. Подчеркивая это, К. Kim и др. указывают, что для большинства исследованных видов микоплазм при указанных выше режимах озвучивания период полураспада (50% выживаемости) был приблизительно равен 5—6 минутам. У более лабильной М. pharyngis этот показатель составлял всего лишь 2—4 минуты. Увеличение частоты ультразвука до 10, кгц обусловливает 5—6-кратное снижение времени, требуемого для гибели 99,99% микоплазм. Увеличение до 20 кгц снижает это время даже до 2 минут и менее. Продолжительная обработка микоплазм ультразвуком приводит не только к гибели этих микроорганизмов, но и вызывает фрагментацию их мембран.
Иррадиация. Исследованиями J. Warren было установлено, что колонии микоплазм различных видов относительно резистентны к ультрафиолетовым лучам. При облучении 4-суточных агаровых культур в течение 1—2 часов микоплазмы сохраняли жизнеспособность, однако они полностью погибали при 3-часовой экспозиции. Наоборот в аэрозольном состоянии чувствительность этих микроорганизмов к ультрафиолетовой иррадиации была очень высокой.
Интересные в этом отношении исследования были проведены несколько позже G. Furness и др. В опытах использовали 3—6-суточные бульонные культуры М. fermentans, М. orale и М. pneumoniae. Считая, что колониеобразующие единицы представляют собой скопления элементарных телец, авторы проводили исследования в двух направлениях. Часть культур после 5-минутного встряхивания в специальном аппарате подвергали фильтрации через миллипоровые мембраны с диаметром пор 0,45 мкм. В фильтратах ,обнаруживали единичные клеточные элементы размером от 100 до 200 нм. Нативные культуры и фильтраты высевали на агаровые пластинки, различное время облучали ультрафиолетовыми лучами (длина волны 2537 А при мощности 220 mW на 1 см2 в секунду) и инкубировали в течение 4—6 суток. Было установлено, что 99% элементарных единиц М. pneumoniae и М. orale инактивировалось на поверхности агара пои указанных выше режимах облучения в течение и 9,6 секунды соответственно. В то же время скопления элементарных клеточных единиц в нативных бульонных культурах инактивировались ультрафиолетовыми лучами на поверхности агара только в течение 2,5 минуты. По мнению авторов, скорость инактивации не зависит от клеточной концентрации и обусловливается интенсивностью иррадиации.
Исследованиями С. Folsome было показано, что A. laidlawii приблизительно в 13 раз чувствительнее к ультрафиолетовой иррадиации, чем Е. сой. Сообщая аналогичные данные, P. Smilh отмечает, что ультрафиолетовые лучи вызывают у A. laidlawii снижение синтеза ДНК и деградацию ДНК, которая показательно изменяется при увеличении дозы ультрафиолетовой иррадиации.
Ссылаясь на свои работы, проведенные ранее, Н. Morowitz сообщает, что при использовании кобальта-60 для изучения чувствительности М. gallisepticum к ионизирующей радиации было установлено, что для этого вида микоплазм летальная доза гамма-лучей составляла 20 300 рад.
Интересные сообщения о влиянии видимого света на A. laidlawii сделали S. Rottem и др. Используя в опытах клетки ахолеплазм с высоким содержанием каратиноидов и без них авторы установили, что под действием видимого света активность аденозинтрифосфатазы у беспигментных клеток в присутствии голубого толуидина снижается на 78%, в то время как у клеток с высоким содержанием пигмента она почти не изменяется. Эти данные позволили авторам сделать заключение о защитной роли каратиноидов у A. laidlawii при воздействии на эти микроорганизмы видимого света. Данный вывод имеет немаловажное значение в связи с тем, что в естественных условиях микроорганизмы этого вида часто могут подвергаться воздействиям солнечных лучей.
Антибиотики. Широкое распространение микоплазм и ахолеплазм в природе, большие трудности выделения этих микроорганизмов из различных объектов, контаминированных бактериальными видами, отсутствие эффективных средств лечения при многих заболеваниях сельскохозяйственных животных, птицы и человека, вызываемых микоплазмами, постоянно вынуждали исследователей изучать чувствительность этих микроорганизмов к различным бактериостатическим веществам и в первую очередь к антибиотикам. Этому вопросу посвящено очень много исследований. Наиболее полно чувствительность микоплазм к различным антибиотикам освещена в работах P. Leberman и др. (1950, 1952), С. Domermuth, Е. Johnson (1955), J. Ward и др. (1958), W. Kohler (1960), J. Lampen и др. (1963), A. Newnham, H. Chu (1965), J. Leclerc (1971), Н. Kato и др. (1972), В.И. Ежова с соавт. (1972) и многих других.
Анализ литературных данных и собственные исследования, проведенные в нашей лаборатории с 50 штаммами микоплазм различного происхождения и ахолеплазм, свидетельствуют о том, что чувствительность этих микроорганизмов к антибиотикам, за редким исключением, не имеет резко выраженных видовых различий и зависит от механизма действия определенных групп антибиотиков.
Микоплазмы и ахолеплазмы обладают относительно высокой резистентностью к антибиотикам, механизм действия которых характеризуется ингибицией синтеза клеточной оболочки. К этой группе антибиотиков в первую очередь относятся пенициллины. Еще в сороковых годах при выделении микоплазм из мочеполового тракта у людей W. Beveridge и др. установили, что эти микроорганизмы обладают высокой резистентностью к пенициллину. В последующем эти данные были подтверждены многочисленными работами зарубежных и отечественных исследователей. Однако исследованиями R. White и J. Ward и др. было установлено, что очень высокие концентрации пенициллина (20—50 тыс. ЕД/мл) все же ингибируют развитие микоплазм. Исключением в этом отношении является М. nеuroliticum, которая ингибируется даже небольшими концентрациями этого антибиотика. При добавлении к питательным средам от 40 до 200 ЕД/мл пенициллина логарифмическая фаза роста и время, необходимое для максимального развития М. neuroliticum, увеличивались, а общее количество популяции снижалось пропорционально концентрации антибиотика. При добавлении к питательным средам 200 ЕД/мл пенициллина рост этого вида микоплазм задерживался на трое суток, и максимальный титр был получен лишь на 6-е сутки инкубации. Концентрация антибиотика в 1000 ЕД/мл вызывала медленное снижение жизнеспособности М. neuroliticum в течение 13 дней. Однако при этом культуры полностью не погибали. По мнению авторов, в дальнейшем пенициллин терял свою активность, в связи с чем при последующей инкубации жизнеспособность М. neuroliticum постепенно повышалась и достигала максимального титра на 16-е сутки. Ингибирующее действие пенициллина устранялось отмыванием или добавлением к культуре пенициллиназы. При периодически повторяющихся пересевах М. neuroliticum на средах с увеличивающимися концентрациями пенициллина авторами был получен нормальный рост этих микроорганизмов. Механизм действия пенициллина на М. neuroliticum не установлен.
Подобно пенициллину циклосерин, бацитрацин и некоторые другие полипептидные антибиотики, механизм действия которых связан с нарушением синтеза клеточной оболочки, также не ингибируют развитие микоплазм и ахолеплазм в обычно применяемых бактериостатических дозах.
Исследованиями J. Lampen и др. установлено, что полиеновые антибиотики, механизм действия которых характеризуется нарушением синтеза цитоплазматической мембраны и нарушением проницаемости клеток, ингибируют развитие микоплазм. Изучая чувствительность М. gallisepticum к различным антибиотикам этой группы, авторы установили, что микоплазмы ингибируются филипином в концентрации 0,5 мкг/мл, амфотерицином В в концентрации 3 мкг/мл и фунгихромином в концентрации 10 мкг/мл. Нистатин и кандидин оказывали ингибирующее действие на микоплазмы в очень высоких концентрациях (100 и 50 мкг/мл соответственно). Эти данные позволяют полагать, что ингибирующее действие полиеновых антибиотиков на микоплазмы зависит от размеров молекулы этих препаратов. Так называемые «малые» полнены — филипин, амфотерицин В и фунгихромин, имеющие меньший размер молекулы (34—37 атомов углерода), лучше проникают в мембрану микоплазм, чем «большие» полиеновые антибиотики (нистатин, кандидин и др.), которые имеют в своей молекуле от 46 до 63 углеродных атомов.
Изучая действие филипина и амфотерицина В на A. laidlawii, М. Weber, S. Kinsky и D. Feingold установили, что эти антибиотики подавляют рост и вызывают лизис клеток при выращивании этих микроорганизмов на питательных средах, содержащих холестерин, но не оказывают аналогичного действия на культуры, выращенные в питательных средах без стерина. Авторами было показано, что клетки A. laidlawii, выращенные в присутствии холестерина, постепенно становятся резистентными к действию указанных полиеновых антибиотиков при последующей их инкубации (37°) в среде, не содержащей холестерина. При более низкой температуре (4°) чувствительность к действию этих полиенов сохраняется.
Изложенные данные убедительно свидетельствуют о том, что ингибиторное действие полиеновых антибиотиков на микоплазмы и ахолеплазмы зависит не только от величины молекулы этих антибиотиков, но и от наличия стерола в цитоплазматической мембране этих микроорганизмов. Аналогичные выводы были сделаны S. Razin и другими исследователями.
Тироцидины, действующие как полиеновые антибиотики на цитоплазматические мембраны клеток, тоже ингибируют развитие микоплазм и ахолеплазм. Исключением в этом отношении являются полимиксины, которые, обладая аналогичным механизмом действия, не ингибируют развитие микоплазм и ахолеплазм в обычно применяемых бактериостатических концентрациях. По данным Н. Kato и др. и многих других исследователей, различные виды микоплазм и ахолеплазм ингибируются полимиксинами только в очень высоких концентрациях (100 мкг/мл и более).
Микоплазмы и ахолеплазмы обладают высокой чувствительностью к различным группам антибиотиков, механизм действия которых связан с нарушениями обменных процессов и подавлением синтеза внутриклеточного белка. К таким антибиотикам в первую очередь относятся: тилозин, спиромицин и некоторые другие макролиды, хлорамфеникол, антибиотики тетрацикл и полого ряда (тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин), амидоглюкозиды (стрептомицин, канамицин, неомицин), линкомицин и некоторые другие. По данным A. Newnham, Н. Chu), R. Ryden, S. Arai и др., Н. Kato и др., Я.P. Коваленко с соавт., наиболее выраженным ингибирующим действием на микоплазмы и ахолеплазмы обладает тилозин. Минимальная ингибирующая доза этого антибиотика для подавляющего большинства известных видов микоплазм и ахолеплазм составляет всего лишь 0,004—1 мкг/мл. Хлорамфеникол, тетрациклин, линкомицин, спиромицин угнетают развитие микоплазм и ахолеплазм в несколько больших концентрациях (0,1—10 мкг/мл).
В отношении ингибирующей концентрации эритромицина на различные виды этих микроорганизмов литературные данные очень противоречивы. Большинство исследователей указывают, что этот антибиотик ингибирует развитие микоплазм в довольно высоких концентрациях. По данным A. Newnham, Н. Chu, R. Slotkin и др., исключением в этом отношении являются виды микоплазм, выделенные от домашней птицы: A. laidlawii и М. pneumoniae.
Более поздними исследованиями Н. Kato и др. было установлено, что М. iners ингибируется эритромицином только в концентрации >100 мкг/мл, в то время как небольшие концентрации этого антибиотика (0,05 мкг/мл) угнетали развитие М. mycoides var. mycoides.
Нет единого мнения у исследователей и в отношении стрептомицина. Многие исследователи считают, что этот антибиотик ингибирует развитие микоплазм и ахолеплазм в очень небольших концентрациях. Однако исследования, проведенные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что многие штаммы микоплазм различных видов и ахолеплазмы (М. mycoides var. capri, М. agalactiae, M. iners, M. gallisepticum, M. arginini, A. laidlawii и др.) ингибируются этим антибиотиком только в концентрациях 50—100 мкг/мл.
При серийном пассировании некоторых видов микоплазм в питательных средах, содержащих стрептомицин, хлорамфеникол, эритромицин и хлортетрациклин, возможно образование мутантов, резистентных к этим антибиотикам.
Химиотерапевтические препараты. Еще в сороковых годах при выделении микоплазм из генитального тракта у людей, Т. Brown, G. Hayes, W. Beveridge установили, что эти микроорганизмы обладают высокой резистентностью к сульфаниламидным препаратам. В дальнейшем эти данные были подтверждены V. Grouре, J. Winn, С. Domermuth, Е. Johnson, G. Bory, F. Entessar, Е. Клинебергер-Нобель и многими другими исследователями. При изучении чувствительности 46 штаммов микоплазм, выделенных из половых органов людей, W. Blyth установил, что сульфаниламидные препараты не оказывали ингибирующего действия на исследованные культуры даже в концентрации 4000 мкг/мл. По данным A. Turner, сульфаниламидные препараты, так же как сульфоны, не ингибировали культуры М. mycoides var. mycoides в концентрации до 1000 мкг/мл. Изоникотиновые гидрозоны, салицилаты и антимониалы тоже не оказывают ингибирующего действия на микоплазмы.
В прошлом многие исследователи сообщали о лечебной эффективности препаратов мышьяка при инфекционной агалактии овец и коз и полиартритах у грызунов, вызываемых микоплазмами. Однако в последующем эти данные полностью не подтвердились. Используя серию поливалентных органических соединений мышьяка, R. Yamamoto, Н. Adler и Н. Adler и др. установили, что альдарсон, карбарсон, трипарсамид, стоварсол и 3-нитро-4-гидроксифенилмышьяковая кислота не оказывали ингибирующего действия па микоплазмы in vitro и не влияли на выживаемость куриных эмбрионов, инфицированных обработанными культурами. В то же время, по данным A. Newnham, Н. Chu, неосальварсан ингибировал развитие микоплазм различных видов in vitro в концентрации от 2 до 200 мкг/мл.
G. Findlay и др., A. Sabin, J. Warren, изучая влияние соединений золота па течение полиартритов у крыс и артритов у мышей, вызванных микоплазмами, установили, что коллоидальное золото не оказывало лечебного эффекта при этих заболеваниях. Неорганические и органические соединения золота алифатического и ароматического ряда благоприятно влияли на течение этих болезней. При применении этих препаратов у 96% инфицированных мышей наблюдали клиническое выздоровление. По данным L. Robinson и др., микоплазмы, выделенные от людей, ингибируются ауротиомолатом в концентрациях 16—128 мкг/мл.
Многие виды микоплазм ингибируются некоторыми антипротозойными препаратами. Изучая чувствительность 14 штаммов микоплазм, выделенных из генитального тракта у людей, из тканевых культур и от животных, L. Robinson и др. установили, что атабрин гидрохлорид ингибировал развитие этих микроорганизмов в концентрации 0,5—4 мкг/мл. Хлорохин дифосфат оказывал ингибирующее действие на микоплазмы в несколько большей концентрации — 32 мкг/мл и более. В то же время большинство исследованных штаммов оказались резистентными к хинин гидрохлориду в концентрации до 128 мкг/мл. По данным A. Turner, атабрин задерживает развитие М. mycoides var. mycoides в концентрации 15,6 мкг/мл.
При изучении чувствительности 36 штаммов микоплазм различного происхождения A. Newnham, Н. Chu обнаружили, что этидиумбромид задерживал развитие микроорганизмов в концентрации 0,1—8 мкг/мл, продидиумбромид ингибирующе действовал в концентрации от 2 до 40 мкг/мл, а антрацидметилсульфат — в концентрации от 2 до 200 мкг/мл.
По данным G. Hagellach, К. Liebermeister, P. Smith, многие тиосоединения тоже оказывают ингибирующее действие на микоплазмы в концентрации 100 мкг/мл и более.
Характеризуя чувствительность микоплазм к нитрофурановым препаратам, многие исследователи указывают, что фуразолидон и фурацилин ингибируют развитие микоплазм в очень широком диапазоне концентрации. По данным A. Turner, A. Newnham, Н. Chu, М. mycoides var. mycoides, М. gallisepticum, другие виды микоплазм, выделенные от птиц и млекопитающих, ингибируются фуразолидоном в концентрации от 0,5 до 40 мкг/мл, а фурацилином в концентрации от 2 до 200 мкг/мл.
Кортизон не оказывает ингибирующего действия на микоплазмы и ахолеплазмы. Однако некоторые ингибиторы стеролового синтеза угнетают их развитие. По данным М. Shifrine и др., бензмалацен в концентрации 5,0 мг% и трипаранол в концентрации 0,4 мг% ингибируют рост A. laidlawii. Ингибиторное действие этих препаратов частично снимается добавлением 1 % сывороточной фракции Difco или холестерола в концентрации 25 мг%. Авторы указывают, что трипаранол в концентрации 0,5—2,0 мг% ингибирует также развитие некоторых видов микоплазм.
Исследованиями P. Smith, С. Henrikson установлено, что ряд других соединений, ингибирующих стероловый биосинтез (α-(р-хлорфенокси)-изомасляная кислота, трихлорид ванадия, β-диэтиламиноэтилдифенилпропил ацетат, фенэтилбигианидхлорпропамид, толбитамид, гераниол, фарнесол, неролидол, цитронеллол, цитронеллал и др.) тоже задерживают развитие A. laidlawii при культивировании этих микроорганизмов в отсутствие стерола.
Используя микоплазмы, выделенные от птиц, D. Schoenhard, D. Padgett установили, что гормон деоксикортикостерон в течение 72-часовой инкубации ингибирует развитие этих микроорганизмов даже при очень невысокой концентрации (0,2 мкг/мл). При испытании лечебного действия деоксикортикостерона триметилацетата на петушках, экспериментально зараженных М. gallisepticum, G. Padgett, D. Schoenhard установили, что двукратное внутримышечное введение этого препарата через 22 и 43 дня после заражения обусловливает полное клиническое выздоровление цыплят.
М. Butler, В. Knight, изучая влияние различных стероидов на развитие микоплазм и ахолеплазм, установили, что Δ2,4 и Δ1,4,6 3-оксихолестен являются сильнодействующими ингибиторами. При культивировании A. laidlawii тип А на специально приготовленных питательных средах, содержащих не более 20 мкг/мл холестерина, указанные выше стероиды ингибировали развитие этого вида микроорганизмов в концентрации 2 мкг/мл. При увеличении содержания холестерина в питательной среде до 200 мкг/мл эта ингибиция снималась. В высоких концентрациях (300 мкг/мл) указанные стероиды ингибировали развитие A. laidlawii тип А и В, М. mycoides var. capri и М. bovigenitalium даже при высоком содержании холестерина в питательных средах.
Интересные исследования были проведены М. Muflic, U. Redmann. Авторы, испытав влияние 200 различных стероидов на развитие М. gallisepticum, установили, что очень немногие из взятых в опыт препаратов способствовали улучшению развития микоплазм но много раз больше, чем холестерол. Некоторые из них не оказывали никакого действия на микоплазмы. В то время как другие ингибировали развитие М. gallisepticum в концентрации от 5 до 100 мкг/мл. По данным U. Redmann, некоторые растворимые в воде стероиды тоже оказывают ингибирующее действие на рост М. gallisepticum в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл.
Неорганические соли, тяжелые металлы и краски. Многие неорганические соли, необходимые для развития микоплазм и ахолеплазм и часто используемые в качестве добавок к питательным средам, в определенных концентрациях угнетающе действуют на эти микроорганизмы. Исследованиями J. Gill, R. Leach, S. Razin, A. Cohen, A. Rodwell установлено, что хлористый калий в концентрации выше 0,04—0,06 M ингибирует развитие некоторых видов микоплазм и ахолеплазм. По данным S. Razin, В. Knigth, М. Tourtellotte и др., фосфаты в концентрации выше 0,04 M угнетают развитие A. laidlawii. Соли марганца, цинка, кобальта и железа тоже оказывают ингибирующее действие на микоплазмы и ахолеплазмы в концентрации от 1 до 100*10в-6 M. Спермин в концентрации 10 мкг/мл и выше становится ингибитором для этих микроорганизмов, также как и сульфит железистого аммония в концентрации 10 мкг/мл.
Еще в 1947 г. D. Edward, а несколько позже Н. Morton, J. Lecce установили, что в отличие от многих видов бактерий микоплазмы обладают высокой резистентностью к ацетату таллия. Дифференциальная чувствительность микоплазм и бактерий к ацетату таллия позволила в дальнейшем многим исследователям использовать ацетат таллия в концентрации 1:1000—1:8000 при выделении различных видов микоплазм и ахолеплазм из объектов, контаминированных бактериями. Более поздними работами М. Shepard, М. Shepard, С. Lunceford было установлено, что в отличие от классических микоплазм так называемые Т-микоплазмы обладают большей чувствительностью к ацетату таллия. По данным D. Taylor-Robinson и др., Т-микоплазмы, выделенные от человека и крупного рогатого скота, частично или полностью ингибируются ацетатом таллия в концентрации 1:200—1:500 (0,2—0,5%), в то время как классические микоплазмы различных видов хорошо развиваются и при концентрации 1:125 (0,8%).
Длительное время считалось, что микоплазмы и ахолеплазмы по чувствительности к ацетату таллия не имеют существенных различий. Однако исследованиями М. Kunze это положение было опровергнуто. Изучая чувствительность 14 штаммов ахолеплазм трех видов и 7 штаммов классических микоплазм шести различных видов, автор установил, что все исследованные культуры микоплазм хорошо развивались на питательных средах при всех использованных концентрациях ацетата таллия (1:125—1:2000), в то время как все исследованные штаммы ахолеплазм частично или полностью ингибировались ацетатом таллия в концентрации 1:125—1:500. Более того, отдельные штаммы A. granularum и A. axanthum очень плохо развивались на питательных средах при концентрации ацетата таллия 1:1000—1:2000. На основании этих данных автор делает заключение о том, что выделение ахолеплазм из различных объектов необходимо проводить на питательных средах без ацетата таллия.
С целью создания селективных питательных сред для выделения микоплазм и разработки методов более четкого выявления колоний этих микроорганизмов с помощью их прижизненного окрашивания многие исследователи занимались изучением влияния различных красок на эти микроорганизмы. D. Edward впервые установил, что микоплазмы недостаточно устойчивы к теллуриту натрия, бриллиантгрюну и генцианвиолету. В последующем эти данные подтвердили P. Smith и др., которые, изучая чувствительность 8 штаммов микоплазм, выделенных от человека, установили, что эти микроорганизмы были резистентными к основному фуксину в концентрации до 10—20 мкг/мл, кристаллвиолету в концентрации более 10 мкг/мл, нильскому голубому А в концентрации до 10 мкг/мл, тионину в концентрации до 25—100 мкг/мл и бриллиантгрюну в концентрации до 5—25 мкг/мл. Однако указанные концентрации использовавшихся красок не всегда полностью обеспечивали ингибицию одновременно исследовавшихся бактерий.
Изучая влияние солей тетразолия на микоплазмы, выделенные от человека, Н. Somerson, Н. Morton установили, что трифенилтетразолиум хлорид в концентрации 0,005% и другие исследовавшиеся соли тетразолия в концентрации 0,00125% не оказывали токсического действия на микоплазмы и при анаэробных условиях редуцировались этими микроорганизмами. Изучая влияние 12 различных красок на микоплазмы шести видов, М. Berliner и др. установили, что бриллианткрезил голубой и акридин оранжевый не имели ценности для прижизненного окрашивания колоний микоплазм из-за своей высокой токсичности для этих микроорганизмов.
В то же время хлоразол черный Е, добавленный в питательные среды в концентрации от 1:50000 до 1:1000, не вызывал ингибиции микоплазм, обеспечивал равномерную прижизненную окраску колоний этих микроорганизмов и увеличение их размеров. По мнению авторов, механизм увеличения диаметра окрашенных колоний был связан со стимуляцией роста этих микроорганизмов данной краской или с аккумуляцией краски мембранами микоплазм.
Поверхностно-активные вещества, энзимы и другие химические агенты. Микоплазмы обладают высокой чувствительностью к соединениям, которые уменьшают поверхностное натяжение. Еще в тридцатых годах F. Tang и др. и G. Seiffert установили, что соли желчных кислот обладают литическим действием на микоплазмы. В последующем эти данные подтвердили P. Smith, R. Linn и другие исследователи. Изучая влияние желчных кислот на микоплазмы, P. Smith, S. Sasaki установили, что ингибиторное действие этих соединений имеет обратную зависимость от количества гидроксильных групп в их молекуле. По их данным, литохолат, содержащий три гидроксильные группы, в концентрации 3,0*10в-5M и 1,5*10в-4М является наиболее сильным ингибитором микоплазм; дезоксихолат, содержащий в молекуле две гидроксильные группы, занимает промежуточное положение, а холевая кислота, содержащая одну гидроксильную группу, в этой же концентрации не вызывает снижения жизнеспособности микоплазм в течение 4 дней при температуре 37°.
Микоплазмы обладают повышенной чувствительностью к мылам. По данным R. Keller и др., добавление в питательную среду мыла в концентрации 10в-3—10в-4M вызывает ингибицию этих микроорганизмов. Соли насыщенных жирных кислот оказывают на микоплазмы литическое действие в более низких концентрациях, чем соли ненасыщенных жирных кислот. Исследования, проведенные P. Smith, J. Boughton, показали, что литическое действие поверхностно-активных веществ, к частности мыл, нейтрализуется протеином и стеролом.
При сравнительном изучении чувствительности нескольких видов микоплазм, протопластов, сферопластов и L-форм бактерии к различным лизирующим факторам S. Razin, М. Argaman установили, что катионные детергенты лизируют микоплазмы в ограниченном диапазоне концентрации (3—7*10в-5М). При более высокой концентрации отмечается увеличение оптической плотности суспензий этих микроорганизмов, что связано, по мнению авторов, с агрегацией клеточных единиц под действием избытка положительно заряженных детергентных попов. Анионные детергенты легко лизируют микоплазмы в концентрации от 10в-5M и более. Предварительная обработка микоплазм уранилнитратом предохраняет их от лизиса катионными и анионными детергентами. Детергенты, не являющиеся ионитами (tween-80 и triton), имеют более низкую литическую активность. При суспендировании исследованных микроорганизмов в сахарозной среде они вообще не вызывали лизиса. Некоторое литическое действие этих детергентов авторы отмечали при суспендировании A. laidlawii в деионизированной воде. Остальные виды микоплазм и L-формы бактерий не лигировались твином-80 и тритоном.
Изучая чувствительность микоплазм к различным энзимам, эти же авторы установили, что лизоцим и папаин He оказывают литического действия на эти микроорганизмы. Трипсин и бромелин вызывали лизис микоплазм только при предварительном прогревании этих микроорганизмов в течение 15 минут при температуре 70°. Несколько позже эти данные были дополнены P. Smith и др., которые, последуя интактные клетки и мембраны A. laidlawii, наблюдали снижение помутнения суспензии в результате их обработки трипсином и химотрипсином. При аналогичных методах исследования целлюлаза не обладала литической активностью. Панкреатическая липаза вызывает лизис микоплазм. Литическая эффективность этого фермента была более выражена при суспендировании микоплазм в 0,067 M фосфатном буфере (pH 7,0), чем в 0,01 M фосфатном буфере с pH 8,0. В то же время фосфолиназа C- и О-гемолизин, продуцируемые Cl. welchii, не оказывали литического действия па М. mycoides var. mycoides. Аналогичные результаты были получены P. Smith и др. при изучении литического действия на A. laidlawii липазы пшеничных зародышей, фосфолипазы Д, полученной из капусты, и фосфолипазы С, продуцируемой Cl. welchii.
По данным этих авторов, фосфолипаза А (яд Crotalus adamanteus) оказывала литическое действие на A. laidlawii. Интересные в этом отношении исследования были проведены Е. Kaklamanis и др., которые установили, что синовиальная жидкость человека, экстракты различных органов мышей, крыс (ливер, почка, кишечник, эмбрион) и клеточных культур в разведении 1:8—1:64 и реже 1:128 являлись литическими для М. neurolyticum. Авторы предполагают, что литическое действие исследованных экстрактов связано с лизолецитином.
В литературе имеется очень много сообщений о стимуляции роста микоплазм некоторыми видами бактерий и продуктами их обмена. Впервые о симбиозе между микоплазмами и бактериями сообщили Н. Morton и др. В последующем эти данные были подтверждены J. Lecce, R. Chalquest, J. Fabricant, G. Monreal и др., С. Mare, W. Switzer и многими другими исследователями. В противоположность этим данным в последние годы в литературе появились сообщения об угнетении развития микоплазм и ахолеплазм некоторыми видами бактерий и продуктами их обмена. A. Bernheimer, М. Davidson, изучая чувствительность микоплазм и ахолеплазм к стафилококковым токсинам, установили, что стафилококковый β-токсин, который не обладал протеолитической активностью, вызывал лизис всех исследованных культур. Однако при этом авторы отметили, что все исследованные штаммы A. laidlawii типа А и В были более чувствительны к β-токсину, чем исследованные штаммы М. gallisepticum и М. neurolyticum. В противоположность β-токсину стрептолизин S не оказывал литического действия на ахолеплазмы, но лизировал все исследованные штаммы микоплазм. Аналогичные результаты, были получены со стрептолизином О. Попытки исследователей изменить чувствительность к стрептолизину О путем выращивания этих микроорганизмов па питательных средах, содержащих холестерин, тоже не увенчались успехом. Необходимо отметить, что исследованные штаммы М. neurolyticum были менее чувствительны к литическому действию стрептолизина О, чем М. gallisepticum. Более высокая стабильность микоплазм этого вида к стрептолизину О и их низкая резистентность к пенициллину позволяют полагать, что М. neurolyticum существенно отличается от других видов микоплазм химическим составом или молекулярной структурой цитоплазматической мембраны.
Используя в опытах 19 штаммов ахолеплазм четырех видов и 7 штаммов микоплазм различных видов, М. Kunze установил, что стафилококки (St. aureus и St. epidermidis) и Pseud, aeruginosa угнетали развитие ахолеплазм и не оказывали никакого влияния на микоплазмы. Степень угнетения ахолеплазм прежде всего зависела от количества сыворотки в питательной среде. Угнетение роста ахолеплазм было наиболее выражено при культивировании этих микроорганизмов на питательных средах без сыворотки. Автором было показано, что угнетение развития ахолеплазм вызывается внеклеточными продуктами обмена указанных выше бактерий. По мнению автора, полученные им данные наряду с другими методами могут быть в дальнейшем использованы для быстрой несерологической дифференциации микоплазм от ахолеплазм.
Исследованиями P. Smith, G. Rotblat, S. Razin, М. Argaman было установлено, что микоплазмы и ахолеплазмы, развивающиеся на питательных средах, содержащих стерол, лизируются дигитанином. При культивировании A. laidlawii на питательной среде без стерола эти микроорганизмы становятся более резистентными к дигитанину.
Микоплазмы и ахолеплазмы очень чувствительны к первичным спиртам. Используя в опытах этанол, n-пропанол и n-бутанол, S. Razin, М. Argaman установили, что литическое действие этих спиртов на микоплазмы и ахолеплазмы зависит от длины цепи их молекулы. Чем длиннее цепь молекулы спирта, тем выше его лидирующая способность. При молярной концентрации указанных выше спиртов n-бутанол был в 4 раза активнее, чем n-параиол и в 10 раз активнее, чем этанол. Этот феномен с микоплазмами и ахолеплазмами идентичен такому же явлению с бактериальными протопластами.
Микоплазмы и ахолеплазмы очень чувствительны к щелочам. Едкий натрий в концентрации 0,0075 M в течение 30 минут при комнатной температуре снижает оптическую плотность суспензий микоплазм и ахолеплазм в сахарозной среде почти в 2 раза. В то же время соляная кислота не вызывала лизиса этих микроорганизмов в концентрации 0,03—5,0 M. По данным G. Sarodoc и др., Я.Р. Коваленко с соавт., микоплазмы лизируются эфиром и хлороформом. Фенол в концентрации 1:200, перекись водорода в соотношении 1:2000—1:10 000, пропиолактон в концентрации 0,1% и выше, перманганат калия в концентрации 1:1000 тоже являются ингибиторами микоплазм.
Сульфатные полисахариды, обычно имеющиеся в агаре, по-видимому, являются основной причиной токсичности некоторых партий агара для микоплазм. Добавление к агаровым питательным средам диэтиламиноэтилдекстрана (10 мг на 100 мл среды) снимает токсичность этих партий агара для микоплазм благодаря связыванию сульфитных полисахаридов.