Морфология, химический состав, рост и развитие микоплазм

24.06.2015

Для микоплазм характерен чрезвычайно выраженный полиморфизм, обусловленный в первую очередь отсутствием твердой клеточной стенки, присущей бактериям, а также сложным циклом развития. Мельчайшие структурные элементы, способные к репродукции в искусственных питательных средах, принято называть минимальными репродуктивными единицами. На форму и размеры минимальных репродуктивных единиц, а также клеточных элементов разных стадий развития существенно влияют условия культивирования, физико-химические свойства питательных сред, особенности штамма и количество пассажей на средах, техника приготовления, фиксации и окраски препаратов и другие факторы.
В связи с тем, что микоплазмы не имеют клеточной стенки, их мембрана и цитоплазма легко повреждаются химическими реактивами, употребляемыми для фиксации и окраски препаратов. Особенно чувствительны к воздействиям факторов внешней среды клетки микоплазм па ранних стадиях развития.
В мазках из пораженных органов и из выращенных в среде культур микоплазмы представлены округлыми, овальными и кольцевидными образованиями. Иногда встречаются коккобациллярные и похожие на бактерии формы. Отдельные виды микоплазм (М. mycoides var. mycoides, М. mycoides var. capri, М. agalacliae) в органах и па питательных средах формируют нитевидные мицелиальные формы.
Электронно-микроскопическими исследованиями и путем фильтрования выращенных культур через мембранные фильтры с известным диаметром нор было показано, что в одной и той же культуре имеются различные по форме и величине образования, способные к репродукции (рис. 1). При исследовании различных видов микоплазм, выделенных из органов животных и человека, а также объектов внешней среды было установлено, что величина элементарных частиц колеблется от 125 до 600 им. В определителе Бердже размер клеток микоплазм исчисляется 125—200 нм. По данным Е. Freundt, величина минимальных репродуктивных единиц микоплазм колеблется между 250—300 нм. Другие авторы определили их размер в пределах 200—500—700 нм, а G. Wildfur, применив метод ультрафильтрации. — 100—150 нм. Следует отметить, что величина клеток микоплазм зависит не только от вида и штамма, но и от других факторов, влияющих на клетку.
Таким образом, размер минимальных репродуктивных единиц в культурах микоплазм варьирует в значительных пределах.

Морфология, химический состав, рост и развитие микоплазм

Структуру минимальных репродуктивных единиц различных видов микоплазм изучали многие авторы, используя электронную микроскопию, ультрацентрифугирование и химический анализ. Было установлено, что вместо клеточной стенки, присущей бактериям, микоплазмы имеют трехслойную мембрану, цитоплазму с ядерным материалом в виде дезоксирибонуклеиновой кислоты, рибосомами и рибосомальными структурами, гранулированным материалом и вакуолями. Мембрана клетки состоит из полярных липидов (фосфолипидов и гликолипидов) и протеинов.
М. Bacharsephat и др. исследовали химический состав штамма Mycoplasma agalaptiae, выделенного из проб молока больной маститом овцы, и установили, что по содержанию и составу нуклеиновых кислот и липидов микоплазмы существенно не отличаются от бактерий (табл. 4).

В отличие от бактерий в состав клеток микоплазм входит стерол, аналогичный холестериновому эфиру. Холестерин локализуется в мембране клеток и у штаммов, требующих для роста холестерин; он составляет около 20% общего мембранного липида. У штаммов A. laidlawii, выращенных в присутствии холестерина, он составляет 7% липида мембраны.
Главным липидным компонентом паразитических видов микоплазм является свободный и этерифицированный холестерин.
По мнению S. Razin, холестерин может служить источником энергии, обеспечивать структурную целостность клеток, входя в состав липидов цитоплазматической мембраны. Наряду с этим холестерин детоксирующе действует на жирные кислоты, лизирующие микоплазмы и способствует, вероятно, проникновению детоксированных жирных кислот в клетки с последующей их утилизацией. Холестерин, глицерин и высокомолекулярные насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты необходимы также для синтеза клеточных компонентов, однако холестерин может быть заменен стероидами и каротиноидами.
По данным S. Razin и др., количество белка в сухой массе различных штаммов микоплазм колеблется от 54 до 62 мг%, а в клеточной мембране — от 47 до 60 мг%. В состав фелка клеток и мембран микоплазм входит до 17 различных аминокислот. Антигенность клеточных мембран микоплазм связана с гидрофобным компонентом мембранных белков. Белки, входящие в клеточную мембрану, выполняют сложную функцию в структурной организации и каталитических процессах клетки, а синтез их осуществляется из свободных аминокислот, поступающих из среды. Белковый компонент мембран включает различные ферменты, играющие основную роль в метаболизме микроорганизмов.
Исследованиями P. Plackett, S. Buttery; P. Plackett показано, что в состав клеток М. mycoides var. mycoides входит до 10% галактана, тогда как сложный полисахарид глюкан обнаруживается у штаммов микоплазм, выделенных от коров. Следы рибозы, маннозы и галактозы обнаружены у других видов микоплазм.
Ультраструктура микоплазм варьирует в зависимости от вида, условий культивирования, метода обработки препаратов, а также от возраста культуры и фазы роста. На примере М. gallisepticum и М. hominis показано, что клетки имеют трехслойную мембрану, ядерный материал с рибонуклеиновой кислотой и рибосомальные структуры, ультрапузырьки с гранулированным материалом и твердые структуры. Большую часть объема клетки микоплазм занимает цитоплазма. Внутриклеточные мембраноидные мезосомоподобные структуры не обнаруживаются. Центральные участки цитоплазмы клеток заполнены ядерным материалом в виде тонких фибрилл ДНК.
Геном клетки микоплазм состоит из циркулярной двухспиральной ДНК, молекулярный вес которой (табл. 5) зависит от вида микоплазм, от величины минимальной репродуктивной единицы, а также от метода исследования. По данным Н. Morowitz и др., показатель содержания ДНК на одну клетку составляет в среднем 240*10в6 дальтон, а по данным А. Riggs, — 300*10в6 дальтон. Применив методику непосредственного осаждения ДНК трихлоруксусной кислотой, Риггс получил несколько иные показателя содержания ДНК — 1200*10в6 дальтон.

Н. Bode, Н. Morowitz сообщили, что для клеток штамма Н39 М. hominis показатель содержания ДНК на одну клетку колеблется от 590 до 750*10в6 дальтон. Эти же авторы считают, что микоплазмы содержат в основном по одному геному на клетку. Геном клетки микоплазм круглой формы имеет величину 5*10в8—5*10в9 дальтон. Репликация генома происходит последовательно в одной точке роста.
По размерам генома и числу цистронов микоплазмы могут быть расположены между Т-фагами и Escherichia coli. Так вид М. gallisepticum по этому признаку ближе подходит к Е. coli, а М. hominis — к Т-фагам. Штамм Н39 М. hominis кодируется 637 цистронами.
По данным A. McGee и др., Н. Neimark и других, микоплазмы содержат дезоксирибонуклеиновую кислоту с низким содержанием гуанина и цитозина. В зависимости от вида микоплазм содержание гуанина и цитозина колеблется от 20 до 40%. Так, в клетках М. mycoides и М. pneumoniae содержание гуанина и цитозина составляет 24—27% от общей суммы азотистых оснований, в клетках A. laidlawii — 35,5%, в клетках М. canis — 33,0, M. gallinarum — 27,7, М. bovigenitalium — 33,0 %.
Таким образом, клетки микоплазм имеют сложную структуру, причём по химическому составу и другим показателям существенно не отличаются от бактерий. Отличительная особенность микоплазм от бактерий — отсутствие клеточной стенки и связанных с ней белковых липидных компонентов.
Поскольку микоплазмы не имеют клеточной стенки, они трудно адаптируются на питательных средах, растут медленно и очень требовательны к различным биологически активным компонентам среды. В жидких питательных средах, включающих различные добавки, обеспечивающие репликацию, микоплазмы вызывают незначительную опалесценцию. Адаптированные к питательной среде культуры вызывают заметное помутнение среды. Отдельные виды и штаммы микоплазм (М. arginini, выделенные от телят и др.) образуют на поверхности бульона еле заметную, легко разбивающуюся маслянистую пленочку.
Некоторые виды микоплазм дают придонный, а другие — поверхностный рост. Локализация роста культуры в жидкой питательной среде зависит от отношения того или иного вида и штамма к кислороду.
В полужидких обогащенных ростовыми добавками питательных средах микоплазмы растут или по уколу, или же образуют крошковатые колонии различной конфигурации, равномерно взвешенные в среде.
При культивировании в жидкой питательной среде микоплазмы обильнее растут ближе к стенке или непосредственно на стенке стеклянного сосуда. Более обильный рост отмечается на стенках сосудов, покрытых тонким слоем питательного агара, что используется для увеличения выхода бактериальной массы при изготовлении антигенов.
В мазках из пораженных тканей, а также из бульонных и агаровых культур клетки микоплазм не окрашиваются по Граму, по хорошо красятся по Романовскому—Гимза и по Динсу. Эти свойства отличают микоплазмы от бактерий.
На плотных питательных средах микоплазмы формируют характерные колонии, напоминающие по форме яичницу-глазунью. Отдельные виды (например, М. gallisepticum) формируют равномерно выпуклые колонии, без четко выделяемого центра (рис. 2 и 3).

В первичных высевах колонии на агаре образуются на 3-и—7-е сутки, тогда как адаптированные к среде штаммы растут значительно быстрее. По нашим наблюдениям, различные штаммы М. mycoides var. mycoides, M mycoides var. capri и M. arginini, выделенные из легких больных бронхопневмониями телят, формируют типичные колонии па сывороточном агаре, с вросшим в среду центром через 48—72 часа инкубирования при температуре 37°. Эти же, а также и другие виды микоплазм, длительно пассированные на сывороточном бульоне Мартена, формируют колонии аналогичной формы через 24 часа. Колонии адаптированных к среде штаммов значительно крупнее, чем свежевыделенных.
При продолжительном культивировании на сывороточных средах многие виды микоплазм образуют в глубине aгаровой среды пятна преципитата вследствие образования липидных компонентов, магниевых и кальциевых соединении. Эти вещества образуются под влиянием ферментов, выделяемых микоплазмами в процессе роста.

По данным Н. Rockl и др., Н. Hartwigk и многих других авторов, а также по нашим данным, типичные колонии микоплазм врастают в агар и формируют вследствие этого более темный центр (рис. 4). Периферия колоний представляется более светлой и менее гранулированной. При световой и фазово-контрастной микроскопии такие колонии похожи на яичницу-глазунью. Отдельные виды микоплазм формируют сосочкообразные и равномерно зернистые колонии. Ввиду того, что колонии микоплазм врастают в среду, пронизывая своими структурными элементами агар, их невозможно снять со среды бактериологической петлей, как это легко удается при пересеве колоний бактерий. Поэтому отвивка колоний микоплазм с плотной питательной среды производится вместе с агаром (агаровый блок).
По внешнему виду колонии микоплазм на обогащенной питательной среде напоминают L-колонии типа ЗА и отличаются от них более зернистой поверхностью и меньшими размерами.

Размер колоний различных видов микоплазм не превышает 0,25—2,0 мм, а некоторые виды образуют настолько мелкие колонии, что их можно обнаружить только при просмотре под микроскопом.
Окрашенные колонии в препаратах с агаровых блоков имеют зернистый вид и нежные, ветвистой структуры края, причем эти ветвистые структуры пронизывают агар (рис. 5).
В настоящее время у микоплазм одного и того же вида описаны колонии гладкого и шероховатого типов, что, по-видимому, связано с диссоциацией. Многие виды микоплазм способны мутировать и образовывать расы, устойчивые к тем или иным антибиотикам. Отдельные виды микоплазм (например, A. laidlawii) способны продуцировать фаги.

Колонии разных видов микоплазм имеют морфологическое сходство, и по культурально-морфологическим свойствам невозможно отличить микоплазмы, выделенные от животных и птиц при различных заболеваниях. Размер и форма колоний зависят не от видовой принадлежности микоплазм, а от качества питательных сред, условий культивирования и других факторов внешней среды. Нa характер роста, скорость репродукции, на морфологию колоний и структурных элементов популяции микроорганизмов также влияют многие факторы.
Пo данным S. Martin и др., видимый рост микоплазм из одних и тех же органов зависит от продолжительности инкубирования первичных посевов (табл. 6).
Увеличение продолжительности инкубации посевов до 10 суток повышает процент выделения микоплазм из одного и того же материала. Эти данные свидетельствуют о том, что учет роста колоний в первичных посевах должен производиться не ранее чем через 10 дней.

Многие исследователи считают, что при незначительной концентрации микроорганизмов в патологическом материале вероятность получения видимого роста на средах незначительна. Поэтому очень важно подобрать соответствующую питательную среду, которая является наиболее благоприятной для роста и развития микоплазм.
S. Martin и др. исследовали более 200 различных проб патологического материала, засевая его одновременно на различные питательные среды. Полученные ими данные сведены в таблицу 7.

В 1927 г. J. Orskow установил, что возбудитель перипневмоний крупного рогатого скота является ветвящимся микроорганизмом, а репродукция его происходит путем образования в ветвистых структурах сферических телец. Позже F. Tang и др. проследили цикл развития Mycoplasma mycoides и выделили пять стадий. По их данным, из элементарных телец формируются нитевидные структуры, которые разветвляются, образуют цепочки, содержащие элементарные тельца. На последней стадии цепочки распадаются, высвобождая элементарные тельца.
Эти данные были подтверждены многими исследователями.
Клинебергер-Нобель считает, что самой маленькой частицей является гранула (минимальная воспроизводительная единица) сферической формы до 125 нм в диаметре. Она не способна к размножению, но превращается в нежную частицу цитоплазмы, не имеющей клеточной стенки. В питательной среде эта мелкая гранула превращается в шаровидную, дископодобную полиморфную или нитевидную клетку, в которой образуется сгущение вещества в виде плотных грядок по периферии. Если нити короткие, сгущение вещества идет только по полюсам, тогда как в длинных нитях вещество располагается по всей длине. Образующийся сгущенный материал дает новые минимальные воспроизводительные единицы.
Как в жидкой, так и в плотной питательной среде каждая единичная нежная частица цитоплазмы, образовавшаяся из гранулы, может давать одну, две или более гранул, что зависит от размера самой клетки. Так как гранулы или теряются материнской клеткой, или остаются прикрепленными к ней, то в последнем случае могут возникать разнообразные формы (рис. 6 и 7). Этим может быть объяснен чрезвычайный полиморфизм клеток в культурах.

Примерно такой же цикл развития микоплазм различного происхождения описали С.Г. Комм с соавт. и Г.Я. Каган, используя метод фазово-контрастной микроскопии и цейтраферной съемки в динамике роста культуры. По данным A. Rodwell, средняя продолжительность одной генерации в культуре микоплазм равна 1,6—1,7 часа.
Н. Morowitz, J. Maniloff исследовали цикл развития М. gallisepticum, применяя электронный микроскоп, седиментационный и химический анализ, и установили, что репродуцирующиеся клетки микроорганизма представляют собой каплевидные формы и имеют объем 5*10в14 см2. Нa конце каплевидной

клетки образовывалось выпячивание. Репродуцирующиеся клетки имели цитоплазматическую мембрану толщиной 110А, а в цитоплазме располагался ядерный материал в виде тончайших нитей ДНК величиной 30 А. В цитоплазме обнаружены рибосомоподобные структуры, величина которых достигала 140 А.
Авторами прослежен процесс деления клетки. После образования на одном полюсе выпячивания появлялось аналогичное выпячивание на другом полюсе. Эти два выпячивания по полюсам отделялись от остальной части клетки так называемой околопузырьковой областью, имеющей зернистое строение, и клетка распадалась на две части. Между двумя вновь образованными клетками сохранялись рибосомы, формировалась перетяжка, после чего их связь друг с другом утрачивалась.
Следовательно, морфология клеток микоплазм в культуре, а также, по-видимому, в органах и тканях животных, зависит от цикла развития клетки. На скорость репродукции влияют различные факторы внешней среды и видовое происхождение микроорганизма. По данным Е. Freundt, S. Razin и др., холестерин, глицерин, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, добавленные в питательные среды, способствуют преобладанию мицелиального роста микоплазм. Виды микоплазм, в цикле развития которых преобладает мицелиальный рост (например, М. mycoides, М. agalactiae, рис. 8), формируют колонии быстрее и крупнее по размерам, так как скорость их прорастания в агар превышает скорость прорастания видов с гранулярным циклом развития.
Кроме описанного, возможен и другой цикл превращения, а также размножение клеток путем деления на две.

Наряду с минимальными репродуктивными единицами в культурах микоплазм обнаруживаются так называемые крупные тела (large bodies). Их природа и значение в жизненном цикле до сих пор неясны. Некоторые исследователи считают их живыми клетками, и вполне возможно, что они представляют собой определенную стадию в цикле развития этих микроорганизмов. Е. Freundt относит крупные тела к дегенеративным, инволюционным формам, не способным к репродукции. Эту точку зрения поддерживают К. Liebermeister, S. Razin, О. Oliver, в исследованиях которых показано, что крупные клетки в культурах микоплазм представляют собой пустые пузырьки, и они не способны формировать колонии на питательном агаре.
К. Kang, L. Kosida для изучения крупных образований в культурах микоплазм использовали препараты, окрашенные флуорохромами примулином и тиофлавином. Было установлено, что крупные тела после образования не увеличиваются в размерах. Авторы считают, что крупные тела в культурах микоплазм, встречающиеся также в культурах L-форм бактерий, являются, по-видимому, скоплением продуктов взаимодействия ферментов бактерий с компонентами питательной среды. Эти образования во время культивирования выполняют роль защитного липидного мешка для минимальных репродуктивных единиц.
Большинство исследователей элементарные тела рассматривают как основную репродуцирующую единицу в цикле превращения клетки микоплазм, появляющуюся на поздних стадиях культивирования. Исследователями показано, что в культуре A. laidlawii число клеток размером более 250 нм совпадало с числом выросших колоний. Элементы меньших размеров оказались не способными к формированию колоний на плотной среде.
Нашими опытами было установлено, что бульонная культура М. mycoides var. mycoides, профильтрованная через стерилизующий фильтр Зейтца, через мембранный фильтр с диаметром пор 250 нм, а также подвергнутая центрифугированию при 15 и 20 тыс. g, содержит морфологически однородные мелкие гранулы, которые при высеве на плотную обогащенную питательную среду не формируют колонии. Если же жидкость с такими гранулами засевали в жидкую питательную среду и после суточной инкубации при 37° — на плотную, то отмечался рост характерных колоний.
Имеющиеся данные позволяют полагать, что минимальные репродуктивные единицы микоплазм имеют существенное отличие от колониеобразующих единиц и представляют собой или какую-то стадию развития клетки из минимальной репродуктивной единицы, или же конгломерат их.