Определение активности комплемента в сыворотке крови калориметрическим методом по Густову

15.11.2014

Приборы: ФЭК, термостат, центрифуга, пробирки центрифужные, пипетки на 0,1; 1; 2; 5; 10 мл, колбы конические, стаканы химические, колбы мерные на 250, 500, 1000 мл.
Реактивы:
Буферные растворы:
1. Основной веронал-мединаловый буфер (рН=7,4) (веронал - 2,875 г, мединал - 1,875 г, хлористый натрий - 42,5 г) разводим до 1 л бидистиллированной водой; веронал и мединал необходимо растворять отдельно, а веронал следует слегка подогреть. Хранить буфер можно 2-3 месяца в холодильнике.
2. Рабочий раствор веронал-мединаловый буфер приготовляют в день исследования из основного (1 часть основного буфера и 4 части бидистиллированной воды).
3. 0,85%-ный раствор хлористого натрия.
4. Взвесь эритроцитов.
Накануне постановки реакции стерильно берут кровь у барана из яремной вены. Дефибринируют ее путем встряхивания во флаконе со стеклянными бусами в течение 15 мин., а затем фильтруют через два слоя марли. Полученные эритроциты сначала отмывают физиологическим раствором, потом рабочим буфером (2-3 раза) путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течение 10 минут. Готовят 2,5%-ную взвесь эритроцитов, для этого необходимо, исходя из количества испытуемых проб, найти по таблице нужный объем эритроцитов и буфера. Стандартизацию проводят на ФЭКе, используя зеленый светофильтр, в кюветах 10 мм. К 1 мл предполагаемой 2,5%-ной взвеси эритроцитов добавляется 9 мл бидистиллированной воды. Калориметрируют против смеси, состоящей из 1 мл буфера и 9 мл бидистиллированной воды. Этот контроль используют при определении опытных проб. Отсчет ведут по красной шкале. Коэффициент экстинции является допустимым в пределах 0,35 ± 0,01. Если экстинция меньше, чем 0,35, то к исходной взвеси эритроцитов добавляют по каплям эритроциты, и, наоборот, разбавляют буфером, если экстинция более 0,35 (табл. 9).

Определение активности комплемента в сыворотке крови калориметрическим методом по Густову

5. Гемолитическая сыворотка: для анализа используют гемолитическую сыворотку с титром не ниже 1 : 1200, которую разводят в четыре раза. Например: титр гемолиза 1 : 1200, расчет делают путем деления 1200 : 4 = 300. Потом рассчитывают количество гемолитической сыворотки по числу исследуемых проб. Если готовят систему на 60 мл, то рассчитывают по формуле:
X = 60 : 300 = 0,2
60,0 - 0,2 = 59,8.

Берут 0,2 мл гемолитической сыворотки, прибавляют 59,8 мл буфера, получают 60.
Ход определения.
В центрифужные пробирки наливают по 3 мл рабочего буфера и вносят по 0,2-0,4 мл (дозу определяют возрастом птицы) сыворотки. Опыт сопровождается постановкой двух контролей:
К1 - (контроль гемолитической системы) - в пробирку вносят 3 мл рабочего раствора буфера.
К2 - (контроль стопроцентного гемолиза) - в пробирку наливают 3 мл бидистиллированной воды.
Равные объемы 2,5%-ной по осадку взвеси эритроцитов и разведенной по тройному титру гемолитической сыворотки смешивают, вливая разведенную сыворотку во взвесь эритроцитов («белое» в «красное»), получают гемолитическую систему.
Опытные пробирки, пробирки К1 и К2, гемолитическую систему ставят в термостат на 30 мин. при температуре +39°С. Затем гемолитическую систему перемешивают и по 2 мл вливают во все пробирки (опытные и контрольные).
Содержимое пробирок осторожно встряхивают и выдерживают в термостате в течение 45 мин. при температуре +39°С. Во время термостатирования через 15 мин. пробы перемешивают, затем пробирки охлаждают 10 мин. в холодильнике и центрифугируют при 3000 об/мин. 10 мин. Надосадочную жидкость калориметрируют на ФЭКе при условиях, аналогичных стандартизации взвеси эритроцитов.
Процент гемолиза вычисляют по формуле:
Х = ОПо / ОПк х 100%,

где: X - процент гемолиза;
ОПо - оптическая плотность опытных проб;
ОПк - оптическая плотность контроля.