Определение комплементарной активности сыворотки крови калориметрическим способом

15.11.2014

Приборы: ФЭК, термостат, центрифуга, пробирки центрифужные, пипетки на 0,1; 1; 2; 5; 10 мл, флакон со стеклянными бусами, марля.
Реактивы: 0,85%-ный раствор хлористого натрия, реактивы для определения гемоглобина, 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана, гемолитическая сыворотка, гемолитическая смесь.
На каждую пробу сыворотки берется три центрифужные пробирки: две - для постановки параллельных проб, одна - для контроля. В первые две пробирки наливают по 5,9 мл физиологического раствора, в третью (контроль) - 5,9 мл дистиллированной воды, затем добавляют по 0,1 мл исследуемой негемолизированной сыворотки. Первые две пробирки ставят на водяную баню при температуре 37-38°С (на 30 минут), третья -инактивируется при 56°С в течение 30 минут.
Далее готовят гемолитическую смесь, в которую включают 2,5% взвеси эритроцитов барана и раствора гемолитической сыворотки на физиологическом растворе в 4-кратном титре.
Взвесь эритроцитов барана готовят следующим образом: кровь барана дефибрилируют путем встряхивания во флаконе со стеклянными бусами в течение 15 минут, а затем фильтруют через два слоя марли. Полученные эритроциты сначала отмывают физиологическим раствором (2-3 раза), путем центрифугирования при 3000 об/мин. в течение 10 минут. После этого определяют содержание гемоглобина и делают расчет потребности в опытных эритроцитах для получения 2,5%-ной взвеси, которая при гемолизе даст 95% гемоглобина.
Например, если в опытных эритроцитах было найдено 60% гемоглобина, то для получения 2,5%-ной взвеси с 95% гемоглобина потребуется взять 3,9575 мл (95% / 60% х 2,5). Для получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов к 3,96 мл отмытых эритроцитов доливают физиологический раствор до 100 мл.
Для анализа используют гемолитическую сыворотку с титром не ниже 1 : 1200, которую разводят в четыре раза. Например: титр гемолиза 1 : 1200, расчет делают путем деления 1200 : 4=300. Потом рассчитывают количество гемолитической сыворотки по числу исследуемых проб. Если готовят систему на 60 мл, то рассчитывают по формуле:

X = 60: 300 = 0,2
60,0 - 0,2 = 59,8.

Следовательно, берут 0,2 мл гемолитической сыворотки, прибавляют 59,8 мл буфера, получают 60.
В равных количествах в 2,5%-ную взвесь эритроцитов вливают раствор гемолизина и получают гемолитическую смесь, которую нагревают в водяной бане 30 минут при температуре 37-38°С.
Затем в каждую из трех пробирок доливают по 4 мл гемолитической смеси. Все пробирки ставят в водяную баню при 37-38°С на 30 минут и периодически осторожно встряхивают. Пробирки с параллельными пробами и контролем центрифугируют в течение 13 минут при 1500 об/мин. После просветления содержимое пробирок подвергается фотокалориметрированию с зеленым светофильтром против воды.
Расчет активности комплемента проводят по формуле:
Х = ОПо / ОПк х 100%,

где: X - процент гемолиза;
ОПо - средняя оптическая плотность опытных проб;
ОПк - оптическая плотность контроля.