Метод определения кетоновых тел по Энгфельду-Пинкуссену
15.11.2014
Реактивы: дистиллированная вода, 0,3 н. гидроксида бария или натрия, 5% ZnSO4, фенолфталеин, 0,01 н. раствор йода, 10%-ный гидроксид натрия, 20%-ная серная кислота, 1%-ный раствор крахмала, 0,01 н. гипосульфит, двухромовокислый калий, концентрированная серная кислота.
Приборы: пипетки на 5 и 10 мл, центрифужные и химические пробирки, отгонные и приемные колбы.
Приготовление реактивов:
1. Бихроматная смесь: 5 г двухромовокислого калия разводиться 50 мл серной кислоты, и добавляется дистиллированная вода до 250 мл.
Ход определения.
Осаждение белков в крови рекомендуется проводить солями тяжелых металлов по методу Сомоджи или Ро и Раису. Для этого к 1 мл крови добавляют 5 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,3 н. Ва(ОН)2 и 2 мл 5% ZnSO4 (вместо окиси бария можно использовать 0,3 н. NаОН). Реактивы должны точно нейтрализовать друг друга по фенолфталеину - объем на объем. Смесь тщательно перемешивают и центрифугируют при 4,5-5 тыс. об/мин в течение 20 минут. Учитывая, что для анализа необходимо иметь 10 мл центрифугата, для осаждения белков обычно берут 2-4 мл биологического субстрата, соответственно увеличив количество остальных компонентов.
Определение кетоновых тел ведут в специальном аппарате, который состоит из перегонной колбы с пришлифованной к ней воронкой, конец которой оттянут в виде узкой трубки до дна колбы. Перегонная колба имеет боковой отвод, соединяющийся с изогнутой под углом трубкой с холодильником. Нижний конец трубки холодильника имеет вид узкой трубки, конец которой достигает дна приемной колбочки. Монтируя аппарат, необходимо следить, чтобы все соединения были хорошо пришлифованы друг к другу. Резиновые трубочки для соединения частей аппарата применять не следует, так как пары, выщелачивая резину, могут извлекать из нее редуцирующие вещества, что может искажать результаты анализа.
Для определения общего количества кетоновых тел в перегонную колбу заливают 10 мл безбелкового центрифугата (10 мл центрифугата соответствуют 1 мл цельной крови) и 15 мл бихроматной смеси (5 г двухромовокислого калия, 50 мл концентрированной серной кислоты и дистиллированная вода до 250 мл). В приемную колбочку наливают 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. раствора йода и 2 мл 10%-ного раствора №ОН. Закрыв кран и проверив все соединения, под перегонную колбу подводят нагревательный прибор и смесь кипятят 25 минут. Необходимо следить, чтобы кипение было равномерным, не слишком бурным и жидкость не выкипала. По истечении этого времени приемную колбочку отделяют от аппарата и помещают на 15 минут в темное место для окончания реакции образования йодоформа.
Одновременно проводится контрольный опыт. Для этого в перегонную колбу наливают вместо центрифугата 10 мл дистиллированной воды и 15 мл бихроматной смеси. В приемную колбочку - те же реактивы, что и в первом случае. Кипячение проводят 25 минут. По окончании дистилляции приемные колбочки отделяют от аппарата и оставляют в темноте на 15 минут.
При титровании в приемные колбочки наливают по 2 мл 20%-ной серной кислоты для освобождения йода, при этом жидкость желтеет. Добавляют 2-3 капли 1 %-ного раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита до полного обесцвечивания жидкости.
Вычисление общего количества кетоновых тел ведут по формуле:
Х = (А - Б) х 0,25 х 100,
где: А - количество (мл) 0,01 н. гипосульфита, израсходованного на связывание свободного йода в контрольной пробе;
Б - количество (мл) 0,01 н. гипосульфита, израсходованного на связывание свободного йода в опытной пробе.
Коэффициент 0,25 вычислен на основании расчета, что 1 мл 0,01 н. йода соответствует 0,25 мг бета-оксимасляной кислоты (общее количество кетоновых тел выражают обычно в мг% бета-оксимасляной кислоты).
При проведении физиологических опытов и выяснении закономерностей обмена веществ чаще всего бывает необходимым определять содержание отдельных компонентов кетоновых тел: концентрацию ацетоуксусной и бета-оксимасляной кислот. При этом дистилляцию ведут в два этапа.
