Определение НЭЖК
15.11.2014
Реактивы: гептан, изопропиловый спирт, 1 н. раствор серной кислоты, бидистилированная вода, 0,01%-ный раствор тимолблау в 20%-ном этиловом спирте, 0,02 н. титрованный раствор гидроксида натрия, 33%-ный гидроксид натрия, пальмитиновая кислота.
Приборы: пробирки с притертой пробкой 10 мл, пробирки центрифужные, горизонтальная микробюретка, 0,1 мл склянка для продувания воздуха через раствор щелочи, мерная колба 100 мл, пипетки емкостью 5, 2, 1 мл, шприц стеклянный емкостью 5 мл.
Приготовление реактивов:
1. Экстрагирующая смесь по Долу: изопропиловый спирт, гептан и 1 н. раствор серной кислоты (40:10:1)
2. Стандартный раствор пальмитиновой кислоты: 15,4 г пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл гептана. Раствор содержит 0,6 мк-экв. жирной кислоты в 1 мл.
Ход определения.
В пробирку с притертой пробкой вносят 0,2 мл сыворотки, приливают 2,5 мл экстрагирующей смеси. Плотно закрывают пробирку и встряхивают в течение 3 минут и оставляют стоять на 10 минут. В пробирке образуется два слоя. В верхнем гептановом слое находятся липиды сыворотки. Из этого слоя пипеткой, соединенной со шприцом, набирают 1 мл раствора и переносят в центрифужную пробирку. Этот объем гептанового экстракта соответствует 0,1 мл сыворотки. В центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл индикатора 0,01% тимолблау.
Титрование ведут 0,02 н. титрованным раствором гидроксида натрия при постоянном перемешивании титруемой смеси воздухом, предварительно пропущенным через 33% гидроксида натрия. Воздух нагнетают резиновым баллончиком от пульверизатора. Титруют до перехода желтого цвета индикатора в синий.
Параллельно проводят контрольное титрование 1 мл чистого гептана в тех же условиях. Для расчета количества НЭЖК сыворотки строят калибровочную кривую. Производят титрование возрастающих количеств стандартного раствора пальмитиновой кислоты, содержащего 0,6 мк-экв./мл. Для этого к экстрагирующей смеси добавляют от 0,1 до 0,7 стандартного раствора (что соответствует 0,03 - 2,1 мк.-экв/мл жирной кислоты в титруемом объеме гептана). Проводят все дальнейшие определения, как указано выше. Объем гептана, добавляемого к экстрагирующей смеси (1,5 мл), соответственно уменьшают на объем стандартного гептанового раствора (также учитывают количество гидроксида натрия, пошедшее на титрование чистого гептана).
Расчет: (пример) на титрование пробы (титруемый экстракт как сказано выше, соответствует 0,1 мл сыворотки) пошло 0,035 мл 0,02 н. раствора гидроксида натрия. На титрование 1 мл гептана израсходовано 0,008 мл гидроксида натрия. Тогда на титрование НЭЖК в 0,1 мл сыворотки пошло 0,035 - 0,008 = 0,027 мл гидроксида натрия. По стандартной колибровочной кривой это количество гидроксида соответствует 0,055 мл экв. пальмитиновой кислоты. В 1 мл сыворотки, таким образом содержится 0,55 мк-экв. НЭЖК.
