Тестирование лекарственных препаратов у верховых спортивных лошадей (допинг-контроль)

13.12.2014

Наездники, ветеринары и люди, увлекающиеся лошадьми, все более обеспокоены относительно использования препаратов и лекарственных средств у лошадей, участвующих в спортивных состязаниях. Несмотря на пользу препаратов и лекарственных средств, их передозировка и применение незаконных препаратов могут скрыть серьезные поражения и изменить характер соревнований. Поэтому частные и государственные распорядительные органы установили правила по применению препаратов и лекарственных средств для защиты здоровья и благополучия лошадей и наездников, и обеспечения честных и справедливых соревнований для всех участников, а также охраны интересов зрителей при заключении пари на тотализаторе.

ОБРАЗЦЫ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ

В большинстве конноспортивных дисциплин для теста берут пробы мочи, поскольку ее легко получить, и большинство препаратов или их метаболиты присутствуют в ней в относительно высоких концентрациях. Проба мочи обычно забирается у лошадей после соревнований. У скаковых лошадей забор пробы обычно не вызывает труда. После скачек победителя и одну или двух других лошадей (выбранных обычно наугад) отводят в безопасную и изолированную конюшню, где их разбирают, замывают и поят. Большинство лошадей иногда мочатся во время этих процедур. Напротив, забор мочи у лошадей для выставок часто вызывает проблемы. Многие лошади для выставок соревнуются в течение всего дня, и часто они стесняются и отказываются мочиться в присутствии специалистов.
Также часто на анализ берут пробу крови, но она в первую очередь используется для контроля за использованием разрешенных лекарственных препаратов, например нестероидных противовоспалительных средств (НПВС). (В Америке применение некоторых НПВС разрешено у выступающих лошадей, а в Европе нет. - прим. пер.). Пороговые концентрации таких препаратов имеются в сыворотке или плазме, и лаборатории производят анализ собранных проб, для того чтобы удостовериться, что максимально допустимая концентрация разрешенного лекарственного препарата не превышает норму.
Обычно методы тестирования препаратов, используемые на сегодняшний день в лабораториях, недостаточно чувствительны для оценки запрещенных веществ в сыворотке или плазме. Например, низкие дозы каких-либо лекарственных средств, например детомидина, мепивакаина и ацепромазина, несмотря на их фармакологическую активность, не определяются в плазме или сыворотке. Напротив, многие лечебные средства можно обнаружить в моче в течение нескольких дней, и даже недель после их последнего введения, и еще в течение долгого времени после того, как они прекратили оказывать какое-либо значительное фармакологическое действие. По этой причине некоторые штаты, например Калифорния, приняли «пороговые решения» или «пределы» для ограничения числа медикаментозных препаратов в зависимости от их концентрации в моче. Цель этих решений заключается в том, чтобы помешать лошадям, находящимся под воздействием запрещенных лекарственных средств, участвовать в соревнованиях, с одновременным предоставлением им наиболее высококачественной медицинской помощи.
ОТБОР ПРОБ

Методику отбора проб нужно рассматривать как с научной, так и с юридической точки зрения. Процесс тестирования препарата начинается после забора пробы мочи и/или крови. Пробирка для забора должна быть новой, чистой и запечатанной, и забор должен производиться так, чтобы предотвратить возможное загрязнение материала из окружающей среды. Затем пробу запечатывают лентой, предохраняющей от повреждений, и транспортируют в лабораторию. Нужно вести аккуратные записи забора проб и их перевозок для обеспечения соответствующей системы контроля. В лабораториях также должны вестись аккуратные записи получения проб и подтверждения внутренней системы контроля. Кроме того, необходимо соблюдать меры безопасности для предупреждения повреждения проб.
МЕТОДОЛОГИЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ
Скрининг проб

После транспортировки в лабораторию пробу подвергают одному или нескольким скрининг-тестам. Желательно, чтобы скрининг осуществлялся быстро и с большой чувствительностью, но его методика не должна обладать высокой специфичностью. В Соединенных Штатах тремя наиболее распространенными методами скрининга, используемыми для обнаружения наличия лекарственных препаратов в пробах мочи у лошадей, являются тонкослойная хроматография, ферментный иммуно-сорбентный тест (ELISA) и анализ с помощью приборов.
Тонкослойная хроматография (TLC)

Лаборатории по исследованию скаковых лошадей уже более 40 лет пользуются методами скрининга с применением TLC. Методика проведения TLC требует много времени, интенсивного труда и во многом зависит от интерпретации специалиста. Чувствительность при обнаружении лекарственного препарата при TLC хуже, чем при современных методах хроматографии. Обычно многие представляющие интерес соединения могут быть обнаружены при помощи TLC, только если их концентрация превышает 100 нг/мл. Однако TLC сохраняет популярность в качестве аналитического метода из-за ее простоты, надежности, низкой стоимости и способности одновременного обнаружения большого количества веществ в ходе одного анализа.
В ходе TLC анализа порции тестируемой пробы проходят ряд экстракций химических веществ, предназначенных для выделения препаратов из эндогенных веществ и концентрации их в небольшом объеме растворителя. Затем полученные экстракты наносятся на тонкую стеклянную пластинку, покрытую адсорбирующим материалом, например силикагелем. Потом пластинка помещается в резервуар с небольшим объемом растворителя (подвижная фаза). Препараты и другие соединения переносятся в верхнюю часть пластинки действием капилляров подвижной фазой со скоростью и на расстоянии, которые зависят от их физико-химических свойств. Различные препараты могут иметь аналогичный образец миграции; поэтому видовое определение препарата на основании TLC анализа носит чисто экспериментальный характер. Уже более 20 лет метод TLC не используется для контрольного подтверждения. Для этого необходимо применение метода масс-спектрометрии у каждого тестируемого образца.
Ферментный иммуно-сорбентный тест (ELISA)

ELISA стал очень распространенным методом в стандартном тестировании препаратов для лошадей из-за его простоты к чувствительности. Большинство лабораторий в Соединенных Штатах используют ELISA в дополнение к методам тестирования TLC, хотя некоторые лаборатории недавно разработали схемы тестирования лишь на основе тестов ELISA. Главными компонентами в ферментном иммуно-сорбентном тесте являются препарат, маркированный определенным ферментом, антитело, специфическое для данного препарата, и субстрат, способный подавать размеренный оптический сигнал (изменение цвета), под действием данного фермента и тестируемой пробы. Антитела, используемые для тестов KLISA, специфичны для одного препарата или класса препаратов, в которых составляющие имеют одинаковую химическую структуру.
В данном тесте маркированный ферментом препарат связывает антитело, цвет которого меняется при добавлении субстрата. При наличии в тестируемой пробе препарата он вступает в борьбу с маркированным ферментом препаратом за участки связывания на антителе. Поскольку с антителами связывается меньшая часть маркированных ферментом препаратов, при добавлении субстрата происходит незначительное изменение цвета, либо он вообще не меняется (рис. 1.10-1). Процеcc тестирования автоматизирован и проходит с помощью микротитрационных планшетов и сканирующего спектрофотометра, который быстро сканирует планшеты на оптимальной для них длине волны и подсчитывает результаты тестов при помощи готовых компьютерных программ. ELlSA предоставляет полуколичественный результат при использовании соответствующих стандартов калибровочных образцов.
Тестирование лекарственных препаратов у верховых спортивных лошадей (допинг-контроль)

Главным преимуществом тестов ELlSA является их чрезвычайная чувствительность. Для многих веществ обнаружение ограничивается 1 нг/мл. Как и с тестом на основе антител, могут возникать неспецифические перекрестные реакции. Поэтому, как и в случае TLC, результаты ELlSA носят лишь экспериментальный характер для обнаружения препарата. Необходимо проведение более точного теста для подтверждения наличия и распознавания препарата.
Анализ с помощью приборов

С появлением недорогих приборов и автоматизированной программы подготовки проб к тестированию препаратов огромную популярность приобретают методы с использованием газохроматографии, масс-спектрометрии (GC-MS) и жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии (LC/MS). Такие приборы обладают широким диапазоном охвата препаратов (> 500 препаратов), превосходной чувствительностью п специфичностью. Хроматография обеспечивает предел обнаружения менее 1 нг/мл при оптимальных условиях экстракции и выделения.
Хроматография работает по принципу «разделяй и властвуй», расщепляя химическую структуру на меньшие, легче опознаваемые частицы. Ионы из меньших частиц, равно как и первоначальные ионизированные исходные молекулы, фокусируются в анализаторе, который измеряет соотношение массы и заряда и массу каждого иона. График отношения избытка ионов к их массе/заряду считается спектром масс данного соединения (рис. 1.10-2). Раньше применялись главным образом газовые хроматографы (GC) для выделения представляющих интерес соединений в пробе перед проведением анализа на масс-спектрометре (GC, MS), однако, недавно стало увеличиваться применение жидкостных хроматографов высокого разрешения в качестве приборов для разделения препаратов. Приборы для жидкостной хроматографии позволяют распознать многие препараты, которые не распознаются с помощью газовой хроматографии, поскольку они обладают слишком большой полярностью и не являются летучими или имеют слишком высокую молекулярную массу. Скрининг проб при помощи методов GC/MS и LC/MS состоит в разделении малых объемов мочи путем экстрагирования на смешанной волне в твердой фазе на две фракции кислотная/основная после чет следует прямой анализ. Было доказано, что модифицированная GC/MS система, предназначенная для введения больших объемов (- 40-50 мкл), является чувствительной, мощной, точной и прочной, обладающей явными преимуществами для скрининга препаратов из основной фракции препаратов. Ловушка ионов LC/MS со встроенным фотодиодным вибрационным анализатором используется для комбинированной кислотной/нейтральной фракции, поскольку данная фракция в общем и целом содержит соединения, которые не являются летучими или но другой причине не пригодны для исследования GC/MS.
Подтверждающий анализ

Если результаты скрининг-теста показывают, что проба может содержать запрещенный препарат или лекарственное средство, персонал лаборатории предпринимает более доскональное исследование пробы для подтверждения наличия подозреваемого препарата или лекарственного средства. Такое подтверждающее исследование проводится на пробах с положительным результатом скрининг-теста, независимо от метода скрининга - TLC, ELISA или анализа с помощью приборов. Для защиты целостности программы тестирования препаратов и чтобы аналитические данные не противоречили законодательным требованиям, результаты подтверждающего процесса тестирования должны быть неоспоримыми. С этой целью применение масс-спектрального анализа в сочетании либо с LC/MS, либо с GC/MS методами стало правилом для подтверждающего тестирования. Спектр масс каждого препарата индивидуален, и поэтому использование данных спектра масс для подтверждающего анализа дает очень высокую степень специфичности. Независимо от вида используемого прибора, с помощью которого производится выделение препарата, результаты спектра масс, полученные GC/MS и LC/MS, обеспечивают индивидуальные «отпечатки пальцев» препарата, которые являются убедительным доказательством его наличия.
Тестирование лекарственных препаратов у верховых спортивных лошадей (допинг-контроль)

АНАЛИЗ «РАСЩЕПЛЕННЫХ ПРОБ»

Как было описано выше, перед тем как составить лабораторный отчет о том, что в пробе содержится какой-то препарат или лекарственное средство, данная проба подвергается строгому анализу и процессу подтверждения исследования с использованием утвержденных аналитических методик. Тем не менее анализ «расщепленной пробы» разрешен многими судебными органами, занимающимися конными соревнованиями. «Расщепленная проба» - это небольшое количество первоначальной пробы, которую наливают в отдельную емкость («обломок пробы») сразу же после забора. Расщепленная проба хранится в замороженном виде в безопасном месте, в отдалении от основной испытательной лаборатории. Если в отчетах основной лаборатории говорится, что в пробе содержится запрещенное вещество, владелец или тренер данной лошади, у которой взята проба, имеет возможность послать расщепленную пробу в другую независимую лабораторию. В этой лаборатории повторяют анализ для подтверждения наличия данного запрещенного вещества. Если вторая лаборатория не может подтвердить данные первой лаборатории о наличии вещества, против тренера или владельца не предпринимаются никакие законодательные действия.
РАЗРЕШЕННЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

У лошадей широко распространено использование НПВС. Постановления, принятые во многих судебных органах США относительно конного спорта, допускают наличие одного НПВС в пробах сыворотки после соревнований, но ограничивают максимальную концентрацию данного препарата, допустимого в этой пробе. Например, во многих предписаниях максимальная концентрация фенилбутазона составляет 5,0 мкг/мл в сыворотке крови. Определение количества НПВС в пробах сыворотки после соревнований обычно производится при помощи высокоспецифичной жидкостной хроматографии с использованием либо ультрафиолетового, либо MS анализатора.
ПОДВЕДЕНИЕ ИТОГОВ

Программы по тестированию препаратов предназначены для соблюдения правил по применению лекарственных средств. Во многих программах процесс исследования состоит из двух этапов, в которых используется моча как первичный образец пробы. Все пробы проходят испытания в процессе предварительного скрининга, а пробы с подозрительными результатами подвергаются дополнительному подтверждающему тестированию.
Наиболее распространенным нарушением, связанным с применением лекарственных препаратов у лошадей, является выявление в исследуемых пробах передозировки разрешенных лекарственных средств. Ветеринары должны знать и строго соблюдать правила применения разрешенных препаратов и лекарственных средств (схемы, дозы), применение которых по тем или иным причинам необходимо до или во время соревнований, во избежание непреднамеренного получения положительных проб мочи.


Добавить комментарий
Имя:*
E-Mail:
Комментарий: